学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

A群猪轮状病毒OSU株VP7基因的克隆及其在杆状病毒中的表达

作　者: 徐宏军
导　师: 王君伟；李一经
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪轮状病毒 VP7基因克隆序列分析重组杆状病毒真核表达
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
下　载: 145次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

猪轮状病毒(Porcine Rotavims，PRV)属弧肠孤病毒科轮状病毒属成员，是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。该病幼畜最为易感，1-4周龄仔猪发病率超过80％，死亡率7-20％，且症状严重，主要表现为严重腹泻，部分病例因严重脱水、酸碱平衡失调、继发感染而死亡。快速准确的诊断和有效免疫预防是本病防制的主要内容。病毒外膜的VP7糖蛋白是RV的主要免疫保护性抗原，由其刺激机体产生的抗体对中和病毒、消除感染起主要作用。因此，该基因的克隆及表达，对于制备新型疫苗和特异性诊断抗原具有重要意义。本研究用恒河猴胚肾细胞(MA-104细胞系)繁殖并扩增了A群PRV G5型标准毒株OSU。根据Genebank已发表的PRV VP7基因cDNA序列，利用Oligo4.1软件设计并合成一对引物，通过反转录—聚合酶链反应(RT—PCR)扩增出长约1.0kb的基因片段，命名为VP7。将其克隆至PMD-18T载体，构建了重组质粒PMD-18T-VP7。对PMD-18T-VP7中的VP7进行序列测定，并将测序结果同仔猪多发的其它四个G血清型代表毒株(G9型ICB2185株、G10型P343株、G4型Gottfried株、G2型—C134株)及OSU-1株(参考序列)的VP7基因进行了序列比较。与OSU-1株的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4％和99.7％。与其它四个毒株的核苷酸同源性分别为77.9％、71.7％、75.3％、87.7％；推导的编码氨基酸同源性分别为83.1％、87.1％、84.7％、96.3％。根据测序结果设计并合成另一对引物，将该基因克隆至真核表达载体PblueBAChisC的BglⅡ和HindⅢ之间的多克隆位点上，命名为重组表达载体PBC-VP7。酶切、PCR及套式PCR鉴定结果表明获得了PRV-VP7基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子。纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sr9，5d后收获重组病毒。重组杆状病毒DNA分子的PCR及酶切鉴定表明，获得了PRV-VP7基因与杆状病毒DNA的重组子，命名为A-1代病毒。将经3次蚀斑筛选纯化后的A-1代病毒接种sf9细胞大量繁殖后收获，PCR鉴定为完全纯化的病毒命名为A-2代病毒。接种A-2代病毒于sf9单层细胞上，4d后收获病变细胞，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫酶斑点技术(Dot-ELISA)分析，表明PRV-VP7基因在杆状病毒表达系统中得到了表达。VP7基因的真核表达，为进一步研究PRV VP7蛋白的结构和功能，研制PRV基因工程疫苗以及制备特异性诊断抗原奠定了基础。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-7
1．前言  7-18
  1．1 RV的生物学性状  7-9
  1．2 RV的分子生物学特征  9-12
  1．3 RV临床诊断研究进展  12-14
  1．4 RV疫苗研究进展  14-15
  1．5 RV基因工程研究进展及展望  15-16
  1．6 杆状病毒-昆虫细胞表达系统的机制及特点  16-17
  1．7 项目研究的目的与意义  17-18
2．材料与方法  18-34
  2．1 实验材料  18-19
  2．2 实验方法  19-34
    2．2．1 PRV的繁殖  19-20
    2．2．2 反转录PRV-VP7基因cDNA的合成  20-21
    2．2．3 VP7基因的扩增  21-22
    2．2．4 VP7基因的分子克隆与鉴定  22-24
    2．2．5 阳性重组子的序列测定及同源性比较  24
    2．2．6 重组表达载体的构建、鉴定与纯化  24-29
    2．2．7 PBC-VP7纯化质粒与杆状病毒共转染  29
    2．2．8 重组杆状病毒的噬斑纯化、鉴定与增殖  29-31
    2．2．9 VP7在杆状病毒中的表达及表达产物的检测  31-34
3．结果  34-47
  3．1 PRV的繁殖与纯化  34-35
  3．2 RV RNA的提取及cDNA的合成  35
  3．3 PRV VP7基因的PCR扩增和克隆  35-37
  3．4 阳性重组子的序列测定及同源性比较  37-41
  3．5 杆状病毒真核表达载体的构建、鉴定与转染  41-44
  3．6 重组杆状病毒的噬斑纯化与鉴定  44-45
  3．7 PRV VP7基因的真核表达及表达产物的检测  45-47
4．讨论  47-50
5．结论  50-51
参考文献  51-57
附录  57-61
致谢  61

A群猪轮状病毒OSU株VP7基因的克隆及其在杆状病毒中的表达

内容摘要

全文目录

相似论文