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口蹄疫病毒非结构蛋白2C\'3AB抗体胶体金检测试纸的研制

作　者: 吴磊
导　师: 刘在新
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒非结构蛋白2C′3AB 多克隆抗体胶体金免疫层析法
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

口蹄疫感染和免疫鉴别诊断技术是防控口蹄疫的重要技术之一。检测多个口蹄疫病毒非结构蛋白抗体,能提高鉴别的准确性。除3ABC非结构蛋白,2C蛋白也有可用性。2C蛋白的N端富积成簇的B细胞表位,试图与3AB蛋白构成2C′3AB发展胶体金检测试纸条。原核表达口蹄疫病毒非结构蛋白2C′3AB,纯化后,与弗氏佐剂、206佐剂和201佐剂分别乳化免疫3组新西兰白兔,四免后心脏采血制备并纯化多克隆抗体,血清效价检测结果表明3种佐剂促进抗体产生的效果依次为:206佐剂>弗氏佐剂>201佐剂。SDS-PAGE结果表明,纯化的多抗纯度高;Western blot鉴定结果显示,多抗可以和阳性血清发生特异性反应,具有良好反应活性;ELISA测定多抗效价>1:51200。胶体金标记口蹄疫病毒非结构蛋白2C′3AB,形成金标探针并将其喷涂于玻璃纤维上, 2C′3AB蛋白和兔抗2C′3AB多抗分别标记于NC膜上两个界定的区域,作为检测带和质控带。各部件按照顺序装配成快速诊断试纸条。检测阴性和阳性血清样本表明,该试制条灵敏度高,特异性强,重复性和稳定性好。与口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA诊断试剂盒检测236份样品,猪阴性血清的符合率达到100%,免疫后猪血清符合率达到97.2%,攻毒后猪血清符合率达到85%,牛阴性血清的符合率达到100%,牛免疫后血清的符合率达到86%,攻毒后牛血清的符合率达到98%,羊阴性血清的符合率达到97.6%,攻毒后羊血清的符合率达到96.3%,符合率高。该试制条用于样品检测,简便、快速,适用于口蹄疫感染和免疫鉴别诊断的快速检测。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章引言  11-18
  1.1 研究目的和意义  11
  1.2 国内外研究现状  11-17
    1.2.1 免疫金标记技术的研究现状  11-12
    1.2.2 胶体金快速诊断技术及其在口蹄疫临床诊断上的研究进展  12-13
    1.2.3 口蹄疫病毒非结构蛋白研究进展  13-16
    1.2.4 鉴别口蹄疫病毒自然感染动物和免疫动物的研究进展  16-17
  1.3 研究内容和方法  17-18
第二章口蹄疫病毒非结构蛋白2C′3AB 多抗的制备和鉴定  18-33
  2.1 材料  18-21
    2.1.1 实验动物  18
    2.1.2 实验试剂  18-20
    2.1.3 实验仪器  20-21
  2.2 方法  21-25
    2.2.1 2C’3AB 重组蛋白的诱导表达  21
    2.2.2 2C’3AB 重组蛋白的纯化  21-22
    2.2.3 重组蛋白浓度的测定  22
    2.2.4 Dot-ELISA 方法分析重组蛋白的活性  22
    2.2.5 多抗的制备和鉴定  22-25
  2.3 结果  25-30
    2.3.1 重组蛋白的表达、纯化和鉴定  25-27
    2.3.2 纯化的重组蛋白的浓度  27-28
    2.3.3 抗原包被浓度和酶标二抗工作浓度的确定  28
    2.3.4 免疫兔血清效价  28-29
    2.3.5 纯化的多抗的SDS-PAGE 分析  29
    2.3.6 纯化的多抗的ELISA 检测效价  29-30
    2.3.7 纯化的多抗的Western blot 鉴定  30
  2.4 小结与讨论  30-33
    2.4.1 抗原的制备  30-31
    2.4.2 免疫动物  31-32
    2.4.3 多抗的纯化  32-33
第三章口蹄疫病毒非结构蛋白2C’3AB 抗体胶体金检测试纸的制备  33-43
  3.1 材料  33
    3.1.1 实验试剂  33
    3.1.2 实验仪器  33
  3.2 方法  33-36
    3.2.1 胶体金的制备  33-34
    3.2.2 免疫胶体金的制备  34
    3.2.3 标记物工作浓度的确定  34-35
    3.2.4 口蹄疫病毒非结构蛋白2C’3AB 抗体胶体金检测试纸的制备  35-36
    3.2.5 试纸条检测方法及结果判定  36
    3.2.6 试纸条的评价试验  36
  3.3 结果  36-40
    3.3.1 胶体金颗粒的测定和稳定性观察  36-37
    3.3.2 免疫胶体金的制备结果  37-38
    3.3.3 标记物工作浓度的测定  38
    3.3.4 评价试验  38-40
  3.4 小结与讨论  40-43
    3.4.1 胶体金和金标记抗原的制备  40-41
    3.4.2 标记物工作浓度的确定和试纸条的制备  41
    3.4.3 金标试纸条的评价试验  41-43
第四章全文结论  43-44
参考文献  44-49
致谢  49-50
作者简介  50

口蹄疫病毒非结构蛋白2C\'3AB抗体胶体金检测试纸的研制

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