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抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因的改造、表达纯化和性质研究

作　者: 张艳红
导　师: 张灏
学　校: 江南大学
专　业: 食品科学
关键词: 黄曲霉毒素B1 单链抗体 定点突变 表达 大肠杆菌 乳酸克鲁维酵母
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


黄曲霉毒素B1（AflatxoniB1,AFB1）是毒性最强的真菌毒素之一,它具有致畸致癌致突变的三致作用,由于它在花生、玉米等食品中广泛存在,因此严重危害了人们的健康。AFB1是一种半抗原,酶联免疫分析法（ELISA）是检验半抗原的一种快速、简便的分析方法,而该检测方法很大程度上依赖于高质量的抗体。与传统免疫动物法获得的抗体相比,重组抗体技术由于采用微生物表达的方法,获得抗体的周期短,成本低,逐渐成为人们研究的热点。本实验在已经从Tomlinson I+J单链抗体文库中筛选出抗AFB1单链抗体基因H4的基础上对其进行表达,以期获得大量与AFB1结合的单链抗体。通过测序发现H4的前1/5处有一琥珀抑制子TAG,说明即TAG没有起到终止作用而是由于密码子的零星改变而被翻译为谷氨酸。为了保证基因不被提前终止,实验中将TAG突变为编码谷氨酸的GAA,之后通过克隆载体、表达载体的构建,再将表达载体转化表达宿主大肠杆菌BL21 （DE3）和乳酸克鲁维酵母GG799,进行诱导表达和生物活性的鉴定实验。结果表明,突变后的H4即H4-Glu能在大肠杆菌BL21 （DE3）中成功表达,表达量为25.5 mg/L,其与AFB1的结合活性明显;H4-Glu在乳酸克鲁维酵母中实现了分泌表达,与AFB1有一定的结合活性,但由于获得的是单拷贝整合转化子,表达量不高。对于获得的抗体,测定了游离AFB1对其的半数抑制率IC50及抗体与AFB2,AFG1,AFG2的交叉反应性。AFB1对抗体的IC50为3.77 ng/mL,抗体与AFB2、AFG1、AFG2均有交叉反应,从强到弱依次为AFG1、AFB2、AFG2。实验发现纯化的抗体在4℃可至少存放3个月;冷冻干燥对抗体的活性有影响,可使其活性损失约50%;抗体可以耐受40℃高温,保温4 h后活性仍可残留40%,但不能耐受50℃高温;中偏碱性条件下有利于抗体的活性保存。本实验成功将抗AFB1单链抗体基因H4中的TAG突变为GAA;分别将其在原核表达系统中的大肠杆菌BL21 （DE3）和真核表达系统中的乳酸克鲁维酵母GG799中获得了成功表达,比较而言,大肠杆菌表达系统更适合于表达抗AFB1单链抗体基因,为AFB1的检测奠定了基础。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
1 引言  8-13
  1.1 黄曲霉毒素的介绍  8
  1.2 黄曲霉毒素的结构、毒性和致癌性  8
  1.3 黄曲霉毒素的检测  8-9
    1.3.1 薄层色谱法( TLC )  9
    1.3.2 高效液相色谱法(HPLC)  9
    1.3.3 酶联免疫吸附法（ELISA）  9
  1.4 抗体的发展  9-10
    1.4.1 抗体的发展  9
    1.4.2 小分子抗体scFv，Fv  9-10
  1.5 噬菌体单链抗体文库  10-11
    1.5.1 噬菌体抗体的筛选  10-11
  1.6 原核及真核表达系统研究进展  11-12
    1.6.1 大肠杆菌表达系统研究进展  11
    1.6.2 真核表达系统研究进展  11-12
  1.7 研究的意义和内容  12-13
    1.7.1 研究的意义  12
    1.7.2 研究的内容  12-13
2 实验材料与方法  13-23
  2.1 实验材料  13-16
    2.1.1 基因、菌株和质粒  13
    2.1.2 实验主要仪器  13-14
    2.1.3 实验主要试剂  14
    2.1.4 培养基配制  14-15
    2.1.5 溶液的配制  15-16
    2.1.6 所用引物序列  16
  2.2 实验方法  16-23
    2.2.1 抗黄曲霉毒素B1 单链抗体基因H4 的定点突变  17-19
    2.2.2 BL21(DE3)-pET226-H4-Glu 的构建和诱导表达  19-20
    2.2.4 GG799-pKLAC1-H4-Glu 的构建和诱导表达  20-21
    2.2.5 抗体性质的测定  21-23
3 结果与讨论  23-36
  3.1 抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因 H4 的定点突变  23-25
    3.1.1 pUCX05-H4 的验证  23
    3.1.2 pUCX05-H4-Glu 的验证  23-25
  3.2 BL21(DE3)-PET228-H4-GLU 的构建和诱导表达  25-27
    3.2.1 pUCX05-H4-Glu(Nco I，Not I)和pET226-H4-Glu 的构建  25-26
    3.2.2 BL21(DE3)-pET226-H4-Glu 诱导表达  26-27
    3.2.3 抗体的特异性鉴定  27
    3.2.4 大肠杆菌中抗体的表达量  27
  3.3 GG799-PKLAC1-H4-GLU 的构建和诱导表达  27-30
    3.3.1 表达载体pKLAC1-H4-Glu 的验证  27-28
    3.3.2 GG799-pKLAC1-H4-Glu 的构建、验证及单拷贝多拷贝的鉴定  28-29
    3.3.3 GG799-pKLAC1-H4-Glu 的诱导表达  29-30
  3.4 原核和真核表达系统表达抗AFB1 单链抗体的比较  30-31
  3.5 抗体性质的研究  31-36
    3.5.1 包被抗原和单链抗体浓度范围的确定  31
    3.5.2 包被抗原和单链抗体最佳工作浓度的确定  31-32
    3.5.3 半数抑制率IC_(50) 和抗体交叉反应的测定  32-33
    3.5.4 冷藏对抗体活性的影响  33-34
    3.5.5 冷冻干燥对抗体活性的影响  34
    3.5.6 温度对抗体活性的影响  34-35
    3.5.7 pH 对抗体活性的影响  35-36
4 结论与展望  36-37
致谢  37-38
参考文献  38-43
附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文  43-44

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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