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猪水肿病大肠杆菌毒力基因突变菌株对猪的免疫效果研究

作　者: 胡文霞
导　师: 师东方
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪水肿病大肠杆菌基因突变菌株免疫应答
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪水肿病（Edema disease of swine,ED）是由某些特定血清型产志贺样毒素大肠杆菌（STEC）引起的断奶仔猪的一种急性致死性传染病。以眼睑、胃壁等处水肿、共济失调、惊厥和麻痹为特征。该病发病急、死亡快、病死率较高。该病主要通过消化道感染,因此针对其黏膜感染的特点,研制有效的口服疫苗对该病的防治具有重要意义。本研究采用挤压法制备大肠杆菌SLT-IIe基因突变菌株(O₁₃₉*)微胶囊,微囊产品的平均粒径为2mm、包裹率为76%,并检测了微胶囊的耐人工胃酸能力、在人工肠液中的肠溶性以及口服安全性。结果显示:微胶囊能耐受pH为1.6的人工胃液3h,在pH为6.8的人工肠液中顺利崩解释放。该微囊对仔猪安全,口服后仔猪的食欲、饮水、增重、精神状态正常,无不良反应。将9头35日龄断奶仔猪随机分成3组,每组3只。分别用突变菌株O139*的微胶囊、突变菌株O139*的菌液和PBS口服免疫,每天1次,连续3d。用间接ELISA方法检测仔猪血清中特异性IgG抗体及粪便中特异性sIgA抗体水平。结果显示,口服微囊组仔猪于免疫后第21 d、28 d,检测到了抗O抗原的IgG抗体（P/N>2）;在免疫后第14 d、21 d、28 d检测到了抗F18ab菌毛蛋白的IgG抗体（P/N>2）;在免疫后的第7 d检测到了抗SLT-ⅡeA蛋白的IgG抗体（P/N>2）;针对SLT-ⅡeB蛋白的IgG与免疫前没有明显变化。口服微胶囊组仔猪于免疫后第7 d、21 d、28 d,检测到了抗SLT-ⅡeA蛋白的sIgA抗体（P/N>2）;在免疫的第14 d、21 d检测到了抗O抗原的sIgA抗体（P/N>2）;在免疫后的第7 d检测到了抗SLT-ⅡeB蛋白的sIgA抗体（P/N>2）。口服菌液组仔猪于免疫后也检测到了针对上述抗原的特异性IgG和sIgA,但抗体水平低于口服微囊组。没有从对照组仔猪的血清和粪便中检测到特异性IgG和sIgA。利用ELISA试剂盒检测了免疫前后仔猪血清中IL- 4、IL-10、IFN-γ的含量变化。结果显示口服微囊组仔猪血清中IL-10显著升高,免疫前219.95 pg/mL,免疫后两周达到354.65 pg/mL;IL-4含量也有升高,免疫前58.146 pg/mL,免疫后三周达到75.762 pg/mL;IFN-γ变化不明显。第3次免疫后21d,仍能从口服微胶囊组和口服菌液组仔猪的粪便样品中检出突变菌株。在最后一次免疫后28d,分别从口服微囊组和对照组随机选择1头仔猪,经耳静脉注射0.8mlSLT-Ⅱe,微囊组仔猪只表现出短时间的不愿走动,食欲下降,24h后恢复正常。对照组仔猪食欲废绝,发热,卧地不起。72 h后剖杀实验猪,微囊组仔猪的组织器官无肉眼可见病理变化,对照组仔猪肝脏边缘有坏死灶、肺脏呈纤维素样病变、胃粘膜和胆囊出现水肿;组织学病理变化显示胃黏膜下层水肿,肝变性、坏死,肺脏、肾脏、脾脏的血管壁通透性增强、红细胞渗出。研究结果证明微囊对突变菌具有良好的抗胃液保护作用,使其在肠道内释放后产生了定植,进一步诱导仔猪产生体液免疫、黏膜免疫,对免疫仔猪具有良好的免疫保护作用。该突变菌株可作为猪水肿病口服毒力基因缺失疫苗研究的候选菌株。

全文目录

摘要  8-10
英文摘要  10-12
1 引言  12-30
  1.1 猪水肿病的概述  12-13
  1.2 猪水肿病的主要致病因子  13-16
    1.2.1 志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）  13-15
    1.2.2 F18ab （F107）菌毛  15-16
  1.3 猪水肿病的发病机理及影响因素  16-18
    1.3.1 发病机理  16
    1.3.2 影响因素  16-18
  1.4 猪水肿病的诊断  18-20
    1.4.1 流行病学  18
    1.4.2 临床症状及剖检病变  18-19
    1.4.3 实验室诊断  19-20
  1.5 猪水肿病的预防  20-23
    1.5.1 药物预防  20-21
    1.5.2 免疫接种  21-23
  1.6 微囊技术  23-28
    1.6.1 微囊的性状及作用  23-24
    1.6.2 制备微囊的主要材料  24
    1.6.3 微囊的主要制备方法  24-27
    1.6.4 活性菌类微生态制剂微囊化的研究  27-28
  1.7 研究目的与意义  28-30
2 材料与方法  30-40
  2.1 实验材料  30-31
    2.1.1 质粒、菌株及实验动物  30
    2.1.2 主要试剂  30
    2.1.3 主要仪器  30-31
  2.2 实验方法  31-40
    2.2.1 大肠杆菌突变菌株 O_(139)* 微囊的制备及性状检测  31-34
    2.2.2 动物免疫及免疫效果检测  34-38
    2.2.3 突变菌株的定植检测  38
    2.2.4 攻毒保护试验  38-40
3 结果  40-63
  3.1 微囊的制备  40-42
    3.1.1 微囊形态与结构  40-41
    3.1.2 微囊的耐人工胃酸试验  41
    3.1.3 微囊的人工肠液溶出试验  41-42
    3.1.4 微囊产品的贮存性能  42
    3.1.5 微囊的安全性评价  42
  3.2 免疫效果检测  42-55
    3.2.1 SLT-IIeA 蛋白的表达和纯化  42-46
    3.2.2 免疫效果测定  46-55
  3.3 突变菌株的定植检测  55-57
  3.4 攻毒保护实验  57-63
    3.4.1 大肠杆菌 SLT-IIe 的提取及检测  57-58
    3.4.2 临床表现  58
    3.4.3 眼观病变  58-59
    3.4.4 病理组织学变化  59-63
4 讨论  63-67
  4.1 微囊制备方法的选择  63-64
  4.2 突变菌株在仔猪肠道内的定植  64
  4.3 黏膜免疫与口服疫苗  64-65
  4.4 仔猪口服突变菌株 O_(139)*免疫效果评价  65-67
5 结论  67-68
致谢  68-69
参考文献  69-74
攻读学位期间发表的学术论文  74

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