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毛竹Na~+转运功能相关基因克隆与表达分析及BIBAC基因组文库的构建

作　者: 杨洋
导　师: 罗淑萍；张智俊
学　校: 新疆农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 毛竹盐胁迫 Na~+/H~+逆向转运蛋白基因克隆基因组文库双元细菌人工染色体
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

盐渍环境下,维持细胞质中Na+的稳态是植物盐适应性的主要机制之一。因此克隆与此功能相关的基因,研究它们在盐胁迫下的功能和分子机制,对于毛竹(Phyllostachys edilus)的耐盐性研究是非常必要的。本研究以毛竹幼苗为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆Na+转运功能相关基因,对其序列进行分析。在此基础上以半定量RT-PCR对这些基因在盐胁迫下的表达模式进行研究。主要结果如下：1)分离出一个液泡膜H--ATP酶c亚基基因(PeVHA-c)全长cDNA序列。该基因全长为634 bp。含有一个495 bp的开放阅读框(ORF),编码含165个氨基酸残基的蛋白。PeVHA-c蛋白分子量为16.6 kDa。该蛋白与其它物种的V-H+-ATP酶c亚基的氨基酸序列同源性很高,在95%以上。2)获得了毛竹液泡膜Na+／H+逆向转运蛋白基因的cDNA全长共2290 bp,命名为PeNHXl.该cDNA的编码区长1635 bp,5′非编码区(UTR)为194 bp,3’UTR为447 bp。其编码的PeNHX1蛋白含545个氨基酸残基。序列分析显示：PeNHX1蛋白与其它植物来源的液泡膜Na+／H+逆向转运蛋白的氨基酸序列同源性很高。数据分析表明,PeNHX1蛋白具有12个跨膜区,其中在第三个跨膜区上,含有Na+／H+逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯吡嗪咪结合位点保守基序"LFFIYLLPPI"。3)获得了毛竹质膜Na+／H+逆向转运蛋白基因的cDNA,全长3674 bp,命名为PeSOSl。该cDNA具有一个3417 bp完整的编码区,以及3’UTR 257 bp。其编码的PeSOS1蛋白含1138个氨基酸残基。数据分析表明PeSOS1蛋白的N端为疏水区,其上具有12个跨膜区,而C端是一个长约700氨基酸残基的亲水性尾巴。系统发育表明,PeSOS1与PeNHX1分属于不同的进化分支,PeNHX1与其他植物液泡膜Na+／H+逆向转运蛋白一起聚为一个进化分支,而PeSOS1所属的进化分支则包括了其他植物以及细菌的质膜Na+／H+逆向转运蛋白。4)半定量RT-PCR分析表明,在200 mmol/L NaCl胁迫下PeVHA-c、PeNHX1和PeSOS1具有不同的诱导表达特征,表现为PeVHA-c在幼苗各部位均受到强烈的诱导,并且持续高表达。PeNHX1和PeSOS1基因在根部的表达量较地上部分更高,且二者在根部的表达调控十分活跃。而PeNHX1在叶片中的表达与调控也很显著。双元细菌人工染色体(Binary BAC, BIBAC)在继承BAC功能的基础上还能够在农杆菌介导下直接将外源基因整合到植物基因组中进行功能验证,大大加速了分子育种的研究进程。本研究在参考前人方法的基础上,初步建立了毛竹基因组BIBAC文库构建技术体系,主要流程包括载体的制备、高分子量基因组DNA的制备与酶切、目的大片段的选择与回收、连接与转化。最终获得了插入片段在90-120 kb之间,重组率较高的阳性克隆。

毛竹Na~+转运功能相关基因克隆与表达分析及BIBAC基因组文库的构建

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