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蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分组分的性质

作　者: 杜学敏
导　师: 武金霞
学　校: 河北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 亲和层析蚯蚓纤溶酶纤溶酶原激活剂糖蛋白
分类号: Q814.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 24次
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内容摘要

用DEAE-Cellulose-32离子交换柱层析部分纯化了大豆胰蛋白酶抑制剂,其分子量为20.1 kD,抑制比为0.9：1。用其为配基,以Sepharose-4B为载体,从赤子爱胜(?)(Eisenia foetida)匀浆液中亲和层析分离了蚯蚓纤溶酶的全组分。探讨了不同活化方法,如羰基二咪唑(CDI)活化法和环氧氯丙烷活化法对偶联率的影响,不同配基,如大豆胰蛋白酶抑制剂和卵清蛋白对亲和结果的影响,以及不同亲和时间、温度、缓冲液pH对亲和吸附的影响。环氧氯丙烷活化法比羰基二咪唑活化法偶联率高。以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基亲和层析可以得到约12个蚯蚓纤溶酶组分,而以卵清蛋白为配基亲和层析只能得到1个主要的蚯蚓纤溶酶组分。随亲和吸附时间的延长,吸附量逐渐增大,3小时吸附量达到饱和；随亲和吸附温度的升高,吸附量呈下降趋势,故亲和吸附应采用较低温度(5℃)；缓冲液pH对亲和吸附影响显著,当缓冲液pH在8.5-9.0时,亲和吸附量最大。用DEAE-Cellulose-52离子交换柱层析法和制备电泳法分离纯化了蚯蚓纤溶酶各单组分(8、9、10号组分为待研究目的组分),研究了这三个组分的生化及酶学性质。组分8、9、10都是有类胰蛋白酶活性的丝氨酸蛋白酶,都是糖蛋白,都能水解酪蛋白、纤维蛋白和BAEE。组分8含有2个亚基,分子量分别为25.5 kD和17.8 kD,具有纤溶酶原激活活性和类胰蛋白酶活性,无类糜蛋白酶活性,纯化的8号组分不具有抗胃蛋白酶水解的能力。组分9只含有一条多肽链,分子量为33.6 kD,组分10含有2个亚基,分子量分别为18.7 kD和10.9 kD。组分9和10都兼有纤溶酶原激活活性和直接纤溶活性,但以纤溶酶原激活活性为主,并兼有类胰蛋白酶和类糜蛋白酶活性。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第1章前言  11-16
  1.1 血栓病的危害及治疗  11-12
  1.2 蚯蚓纤溶酶研究概况  12-15
    1.2.1 药理学  12
    1.2.2 酶学、生化性质  12-13
    1.2.3 抗原性  13-14
    1.2.4 基因克隆表达  14
    1.2.5 N-末端序列分析  14
    1.2.6 固定化  14-15
  1.3 前期研究、本论文的主要研究内容及意义  15-16
第2章大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)的分离纯化  16-26
  2.1 材料与方法  16-21
    2.1.1 材料  16
    2.1.2 试剂  16
    2.1.3 仪器  16
    2.1.4 方法  16-21
  2.2 结果与讨论  21-25
    2.2.1 蛋白浓度标准曲线  21
    2.2.2 SBTI的DEAE-Cellulose-32柱层析  21-22
    2.2.3 SBTI活性峰的确定  22-23
    2.2.4 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测  23
    2.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测  23-24
    2.2.6 纯化后SBTI的抑制比  24-25
  2.3 小结  25-26
第3章亲和层析分离蚯蚓纤溶酶(EFEs)全组分  26-37
  3.1 引言  26
    3.1.1 亲和层析简介  26
    3.1.2 大豆胰蛋白酶抑制剂简介  26
    3.1.3 卵清蛋白简介  26
  3.2 材料与方法  26-29
    3.2.1 材料  27
    3.2.2 试剂  27
    3.2.3 仪器  27
    3.2.4 方法  27-29
  3.3 结果与讨论  29-36
    3.3.1 卵清蛋白抑制比  29-30
    3.3.2 偶联率的比较  30-31
    3.3.3 各亲和层析柱的实验结果  31-33
    3.3.4 亲和层析条件的优化  33-36
  3.4 小结  36-37
第4章蚯蚓纤溶酶单组分的分离纯化  37-42
  4.1 材料与方法  37
    4.1.1 材料  37
    4.1.2 试剂  37
    4.1.3 仪器  37
    4.1.4 方法  37
  4.2 结果与讨论  37-41
    4.2.1 蚯蚓纤溶酶全组分的DEAE-Cellulose-52层析  37-40
    4.2.2 制备电泳纯化蚯蚓纤溶酶各单组分  40-41
  4.3 小结  41-42
第5章蚯蚓纤溶酶单组分的性质研究  42-54
  5.1 材料与方法  42-44
    5.1.1 材料  42
    5.1.2 试剂  42
    5.1.3 仪器  42-43
    5.1.4 方法  43-44
  5.2 结果与讨论  44-52
    5.2.1 蚯蚓纤溶酶各组分活性的测定  44-47
    5.2.2 蚯蚓纤溶酶各组分分子量的测定  47-48
    5.2.3 不同抑制剂对蚯蚓纤溶酶各组分的作用  48-51
    5.2.4 蚯蚓纤溶酶各组分糖蛋白性质  51-52
    5.2.5 胃蛋白酶对蚯蚓纤溶酶8号组分的作用  52
  5.3 小结  52-54
第6章结论  54-55
参考文献  55-59
致谢  59

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分组分的性质

内容摘要

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