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狂犬病病毒糖蛋白基因重组逆转录病毒的构建及其免疫原性研究

作　者: 赵娜
导　师: 胡永浩；扈荣良
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 狂犬病糖蛋白重组逆转录病毒免疫效果
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

逆转录病毒载体是一种复制缺陷型病毒载体,以该载体构建的重组逆转录病毒可以在包装细胞系内大量增殖,病毒感染后可将其基因组整合到宿主细胞内,从而实现外源基因的持续稳定表达,免疫动物则可获得持久的免疫保护反应。本研究以逆转录病毒载体pLNCX为基础,将狂犬病病毒糖蛋白基因克隆到pLNCX载体的两个长末端重复序列(LTR)之间,转染包装细胞,获得重组病毒后免疫动物,检测受试动物的特异性抗体保护水平。经RT-PCR扩增狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因,克隆至pMD18-T载体并测序,将测序分析正确的糖蛋白基因克隆至真核表达载体pVAX1内,酶切并经凝胶回收获得糖蛋白基因表达盒,插入逆转录病毒载体pLNCL的两个长末端重复序列中间,并同时缺失载体内CMV启动子,获得含有糖蛋白基因的重组质粒pLNC-G。以碱裂解法大量制备重组质粒pLNC-G,脂质体介导转染逆转录病毒包装细胞PA317,通过400μg/mL的G418压力筛选,获得稳定转染细胞系。细胞传代后提取细胞基因组,利用PCR方法,证实糖蛋白基因整合到PA317细胞基因组中,并能稳定地随宿主细胞传代。提取细胞总RNA,RT-PCR法证实G基因可被稳定转录。产毒细胞上清在NIH3T3细胞上的病毒滴度为0.8×103～1.2×104CFU/mL。选择滴度较高的产毒细胞系,扩大培养收获重组病毒,免疫昆明小鼠。1.2×104CFU/mL重组病毒以腹腔、肌肉注射两种途径免疫小鼠,免疫后每2周采集血液,分离血清,以FAVN法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体效价。结果显示,该重组病毒可以诱导机体产生良好的体液免疫应答,肌肉和腹腔注射均可使部分小鼠产生抗狂犬病的中和抗体,其阳转率分别为6.7%和86.7%。

全文目录

中文摘要  2-3
Summary  3-4
缩略语  4-9
第一篇文献综述  9-25
  第一章狂犬病疫苗的研究现状  9-19
    1 狂犬病病毒的分子生物学特性  9
    2 动物用狂犬病疫苗研究现状  9-12
      2.1 动物用狂犬疫苗历史  9-10
      2.2 修饰的活病毒疫苗  10
      2.3 灭活的狂犬病疫苗  10-11
      2.4 NIH 测试  11
      2.5 疫苗接种后的并发症  11
      2.6 动物狂犬病疫苗的免疫覆盖率  11-12
      2.7 动物用狂犬病疫苗类型和使用  12
    3 狂犬病新型疫苗  12-19
      3.1 野生动物口服狂犬病疫苗  12-16
      3.2 狂犬病核酸疫苗  16-19
  第二章逆转录病毒载体的背景与应用  19-25
    1 逆转录病毒载体背景  19-22
      1.1 逆转录病毒  19
      1.2 逆转录病毒的生活周期  19-20
      1.3 逆转录病毒载体  20-21
      1.4 逆转录病毒载体表达系统的构成  21
      1.5 包装细胞  21-22
    2 逆转录病毒载体的优点  22
    3 逆转录病毒载体系统的安全性问题及其解决策略  22-23
      3.1 有复制能力逆转录病毒的感染  22-23
      3.2 逆转录病毒载体在靶细胞基因组的整合  23
      3.3 灵敏的RCR 检测系统  23
    4 逆转录病毒载体的应用前景  23-25
第二篇试验研究  25-56
  第三章狂犬病病毒SRV9 株G 基因重组逆转录病毒表达载体的构建  25-43
    1 材料  25-27
      1.1 菌种、毒株与质粒  25
      1.2 试剂  25
      1.3 主要仪器  25-26
      1.4 培养基、抗生素及主要溶液的配制  26-27
    2 方法  27-37
      2.1 感受态菌的制备  27
      2.2 连接物的转化  27-28
      2.3 SDS 碱裂解法小量质粒DNA 的制备  28
      2.4 DNA 琼脂糖凝胶电泳  28
      2.5 质粒的酶切鉴定  28
      2.6 琼脂糖凝胶回收  28-29
      2.7 酶切DNA 片段的3′凹端的补平  29
      2.8 酶切DNA 片段的5′凹端的补平  29-30
      2.9 线性质粒DNA 片段的5′端去磷  30
      2.10 产物连接  30
      2.11 RV 弱毒株SRV9 G 基因扩增及测序  30-32
      2.12 重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定  32-36
      2.13 质粒DNA 的大量制备（碱裂解法）  36-37
    3 结果  37-41
      3.1 狂犬病毒SRV9 株糖蛋白的克隆及序列分析结果  37-40
      3.2 重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定  40-41
    4 讨论  41-42
      4.1 狂犬病毒抗原基因的选择  41-42
      4.2 目的基因的测序结果分析  42
      4.3 逆转录病毒载体的选择  42
    5 小结  42-43
  第四章重组逆转录病毒的包装及其在PA317 细胞中的表达  43-51
    1 材料  43-44
      1.1 细胞  43
      1.2 培养基、主要试剂及其配制  43-44
    2 方法  44-47
      2.1 细胞的复苏  44
      2.2 PA317 细胞培养及传代  44
      2.3 PA317 细胞的冻存  44
      2.4 PA317 对G418 最小致死剂量的测定  44-45
      2.5 脂质体介导的重组逆转录病毒载体转染PA317 细胞  45
      2.6 G418 抗性细胞的筛选  45
      2.7 产毒细胞的克隆  45-46
      2.8 克隆细胞株基因组的提取  46
      2.9 PCR 扩增检测质粒载体整合  46
      2.10 产毒细胞上清的收取及浓缩  46-47
      2.11 NIH3T3 细胞的复苏、传代培养及冻存同PA317 细胞  47
      2.12 糖蛋白重组逆转录病毒滴度的测定[85]  47
      2.13 高滴度重组病毒的筛选  47
      2.14 重组逆转录病毒介导糖蛋白基因在PA317 细胞中稳定表达  47
      2.15 逆转录病毒RNA 的提取及RT-PCR  47
    3 结果  47-49
      3.1 G418 对PA317 细胞最小致死剂量的测定  47-48
      3.2 转染重组质粒阳性的PA317 细胞克隆的形成  48
      3.3 PCR 检测细胞克隆株基因组中重组载体的整合  48
      3.4 重组病毒感染滴度测定  48-49
      3.5 RT-PCR 结果  49
    4 讨论  49-50
      4.1 重组逆转录病毒的包装  49-50
      4.2 细胞克隆的获得  50
      4.3 病毒感染滴度的测定  50
    5 小结  50-51
  第五章狂犬病糖蛋白重组逆转录病毒的免疫原性研究  51-56
    1 材料  51
      1.1 病毒及细胞  51
      1.2 试验动物  51
      1.3 主要试剂及仪器  51
    2 方法  51-53
      2.1 实验动物分组、免疫与采血  51
      2.2 荧光抗体中和试验  51-53
    3 结果  53-54
      3.1 FAVN 方法测定血清中和抗体的效价  53-54
    4 讨论  54-55
      4.1 中和抗体检测方法  54
      4.2 免疫途径  54
      4.3 疫苗效果评价  54-55
    5 小结  55-56
参考文献  56-62
致谢  62-64
导师简介  64-65
作者简介  65-66

狂犬病病毒糖蛋白基因重组逆转录病毒的构建及其免疫原性研究

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