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BCR/ABL和SEA双基因重组载体的构建和表达及SEA联合K562细胞对CD3ε链的影响

作　者: 田红霞
导　师: 林晨
学　校: 暨南大学
专　业: 病原生物学
关键词: BCR/ABL基因 金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA) 慢性粒细胞白血病(CML) DNA疫苗 CD3ε链 实时定量PCR
分类号: R73-36
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：构建和表达含BCR／ABL融合基因和葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核双表达质粒,为提高超抗原抗肿瘤的效果提供新的免疫治疗方向；探讨金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对K562细胞诱导正常人脐带血T细胞CD3ε链表达的影响,进一步探讨SEA增强K562细胞诱导T细胞活化的机制。方法：1.利用RT-PCR技术从K562细胞中扩增出含BCR／ABL融合位点的基因片段,提取金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增出SEA基因,分别将两基因片段连在pIRES载体的多克隆位点A和B上,构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL重组质粒。将重组质粒转染K293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒在真核细胞的转录情况,SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白在真核细胞的表达。2.常规分离4例脐带血单个核细胞,分别与抗CD3单克隆抗体、单纯K562细胞、单纯SEA以及SEA联合K562细胞共培养,诱导T细胞活化增殖,并设空白对照组。刺激培养48h后收集各组细胞提取mRNA并合成cDNA,以p2-微球蛋白基因作为内参,采用实时荧光定量PCR检测在不同组别中CD3ε链的表达情况,根据公式2-ΔΔCt对CD3ε链的表达差异倍数进行相对定量分析。结果：1.成功扩增出BCR/ABL和SEA基因片段；双酶切鉴定BCR／ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL重组质粒中含有BCR/ABL和SEA基因,经基因测序证实完全正确；将重组质粒转染K293细胞后,经RT-PCR扩增鉴定,插入到重组质粒的BCR／ABL和SEA基因能在真核细胞正常转录,经SDS-PAGE电泳鉴定重组质粒能够在真核细胞中表达BCR／ABL和SEA蛋白。2.K562细胞组CD3ε链表达水平略有降低,抗CD3单抗组、SEA组、SEA联合K562细胞组的诱导活化的T细胞CD3ε链基因均有表达增强,而SEA联合K562细胞组的CD3ε链表达明显高于单纯SEA组(P<0.01)。结论：成功构建了BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL真核双表达质粒,该重组质粒能够在真核细胞中正常转录并表达BCR／ABL和SEA蛋白；超抗原SEA可以增加K562细胞在体外诱导脐带血中T淋巴细胞的CD3ε链表达。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
目录  8-10
一 前言  10-23
  1. BCR/ABL融合基因  10-12
  2. CML的治疗现状和发展趋势  12-17
  3. 超抗原SEA的研究现状  17-21
  4. SEA与CD3ε链  21-22
  5. 本实验的研究目的、内容及意义  22-23
二 材料和方法  23-50
  1. 主要实验仪器及设备  23-24
  2. 主要实验材料和试剂  24-27
  3. 本课题的技术路线  27-29
  4. 实验方法  29-33
  5. 第一部分实验步骤  33-48
  6. 第二部分实验步骤  48-50
三 结果  50-62
  1. 第一部分实验结果  50-60
  2. 第二部分实验结果  60-62
四 讨论  62-70
  1. BCR/ABL融合基因片段的选择  62-63
  2. 免疫佐剂的选择  63-65
  3. 构建质粒的选择  65-66
  4. 超抗原SEA对K562细胞诱导脐带血单个核细胞CD3ε链的影响  66-68
  5. 本次实验存在的问题及探讨  68-69
  6. 进一步设想  69-70
五 结论  70-71
参考文献  71-79
附录一 英文缩略词表  79-81
附录二 各重组质粒的测序结果  81-84
附录三 BCR/ABL-pIRES-SEA双表达质粒构建流程图  84-85
附录四 在校发表论文  85-86
附录五 参加学术会议情况  86
附录六 本研究基金项目  86-87
致谢  87

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究 > 治疗实验
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