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新型免疫刺激分子增强DNA疫苗免疫原性的研究
作 者: 吴娟
导 师: 罗玉萍；范小勇
学 校: 南昌大学
专 业: 微生物学
关键词: 热休克蛋白65 CpG基序 DNA疫苗 免疫原性 内含子A
分类号: S852.52
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
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Hsp65作为DNA疫苗的模式抗原是机体对抗结核分枝杆菌入侵的重要免疫保护性及治疗抗原。然而,增强DNA疫苗免疫效果则是令人期待的。因此我们构建麻风分枝杆菌热休克蛋白65 (Heat shock protein 65, Hsp65)的原核表达载体,诱导表达、纯化该重组蛋白并制备Anti-Hsp65小鼠多克隆抗体；并探讨在麻风分枝杆菌热休克蛋白Hsp65终止密码与真核表达载体polyA之间插入CpG基序以提高DNA疫苗在小鼠中诱导的细胞免疫和体液免疫；同时探讨以内含子A增强Hsp65在真核细胞中的表达效率及提高DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫原性。通过ELISA、ELISPOT和胞内细胞因子染色技术等实验方法进行分析,结果小结如下：1、PCR扩增所获得hsp65基因序列与GenBank公布的完全一致,表达的融合蛋白相对分子质量约65kDa, ELISA测定表明Anti-Hsp65多克隆抗体效价约为1:12,800, Western-blotting分析表明该多克隆抗体具有良好的反应特异性；2、含有CpG02的重组质粒瞬时转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,其IFN-α, IL-12, IL-17A和IL-6的mRNA相对表达水平明显增加,但IL-4和CD86的mRNA相对表达水平没有统计学差异,免疫小鼠后诱导产生Anti-Hsp65特异性总IgG和IgG2a抗体水平也更高,分泌IFN-y的T淋巴细胞频率也增加；3、含有内含子A的重组表达质粒pCMV4.0hsp65较之不含内含子A的pVAX1hsp65在人胚肾上皮细胞系293T细胞中的抗原表达量更高,免疫小鼠后诱导产生的Anti-Hsp65特异性总IgG和IgG2a抗体水平也更高,分泌IFN-y的CD4+和CD8+T淋巴细胞频率增加。经过上述验证,我们成功表达与纯化了麻风分枝杆菌Hsp65的重组蛋白,并制备了效价及特异性良好的Anti-Hsp65小鼠多克隆抗体：在抗原转录区下游插入CpG免疫刺激基序能更好地提高DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫原性；内含子A可增强Hsp65在真核细胞中的表达效率并可提高DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫原性。
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学 > 免疫法预防（接种）
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