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IBD患者粪便菌群生物多样性及其主要组成的研究

作　者: 沙素梅
导　师: 吴开春
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: 炎症性肠病克罗恩病溃疡性结肠炎肠道细菌实时定量PCR 变性梯度凝胶电泳
分类号: R574
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease ,IBD)主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)两种类型。该疾病具有发病早,病程缓,易复发的特点,往往需要长期治疗,费用昂贵,严重影响生活质量和工作效率。IBD发病机制至今仍然不明确,目前认为IBD的发病是由遗传因素、环境因素、肠道细菌和肠道免疫系统失调等多种因素相互作用所致,动物和临床实验均表明肠道菌群在IBD的发生发展中起重要作用,此外益生菌制剂治疗IBD显示出安全有效、无不良反应等优点,临床应用前景充满希望。由于大多数的肠道细菌无法进行体外培养,本实验拟采用实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)、指纹图谱等分子生物学方法探讨IBD患者粪便常见优势菌群的变化,并初步研究IBD患者肠道微生物的生物多样性。方法收集2009年3月～2010年8月在我院确诊的IBD病人(包括26例UC:活动期/缓解期11/15,10例活动期CD),分别利用UCAI及CDAI评价方法将UC和CD病例分为活动期和缓解期。同时选取年龄性别相匹配的健康人(共14例)作为对照组,收集实验组和对照组新鲜大便标本,提取粪便细菌基因组DNA,应用实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)定量分析粪便中拟杆菌属、双歧杆菌、缠绕杆菌属、乳酸菌、肠球菌、脆弱杆菌属和梭状芽孢杆菌这些已知优势菌群的含量变化,将结果转化为Log10CFU进行统计分析。同时应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)测定肠道菌群的生物多样性,回收DGGE电泳条带并测序比对,初步分析实验组和对照组的肠道菌群多样性。结果优势菌群的定量检测发现,与正常对照组相比,肠道拟杆菌在活动期UC(8.49 vs 7.03,P=0.014)和CD(8.49 vs 5.52,P=0.003)患者中明显减少但在缓解期UC患者(8.49 vs 8.33,P>0.05)没有明显变化;活动期UC(7.97 vs 7.59,P=0.016)和CD(7.97 vs 7.51,P=0.001)患者肠道双歧杆菌数量减少,而缓解期UC患者与健康对照(7.97 vs 7.93, P>0.05)之间没有明显差异;活动期UC(5.76 vs 5.24,P=0.001)、缓解期UC(5.76 vs 5.31,P=0.000)和CD(5.76 vs 5.18,P=0.000)患者肠道缠绕杆菌属数量均降低;肠道乳酸杆菌数量在UC和CD患者有降低的趋势,但是与健康对照组相比并没有统计学差异;缓解期UC肠道肠球菌也存在同样的结果(4.76 vs 4.97,P=0.297),,但是在活动期UC(4.76 vs 4.42,P=0.014)中是减少而活动期CD患者(4.76 vs 5.84,P=0.003)肠道则是增多的;跟健康对照者相比,脆弱杆菌在活动期UC(9.25 vs 6.84,P=0.000)和CD患者(9.25 vs 6.12,P=0.000)中均降低,在缓解期UC中(9.25 vs 8.22,P=0.000)也有这种现象,但不如活动期疾病明显;此外,缓解期UC(9.25 vs 8.22;P=0.000)、活动期CD(9.25 vs 6.84;P=0.000)和活动期CD(9.25 vs 6.74; P=0.000)梭状芽孢杆菌数量均比健康对照减少。DGGE结果显示个体之间的细菌指纹图谱存在较大差异,IBD患者的条带与健康对照者明显不同,主要由3～5条条带构成,总体而言,IBD患者尤其CD患者的肠道细菌多样性是降低的。将所有IBD患者和健康对照者的条带进行比较,发现504个Dice相似系数范围从3.5%到88.9%,组间相似系数均低于组内相似系数,健康对照与活动期UC、缓解期UC和活动期CD相比分别为29.10±13.57%, 35.66±10.38%,25.47±20.50%。DGGE条带测序的结果显示这些细菌多数属于不能培养的环境细菌,主要包括变形菌门、拟杆菌门和硬壁菌门,尤其硬壁菌门是疾病组和健康对照组的主要菌群。结论我们的结果表明在IBD患者中肠道菌群发生了明显的变化,整体来说是有害细菌增多而有益菌群减少;通过DGGE发现,肠道细菌组成复杂、个体差异明显,IBD患者肠道细菌生物多样性降低,以CD更明显,多数肠道细菌属于不能培养的细菌,证明了肠道细菌的复杂性。

全文目录

缩略语表  6-9
中文摘要  9-12
ABSTRACT  12-16
前言  16-19
文献回顾  19-31
实验一构建质粒标准品  31-43
  1 材料  31-32
  2 方法  32-38
  3 结果  38-41
  4 讨论  41-43
实验二肠道主要优势菌群的定量分析  43-53
  1 材料  43-44
  2 方法  44-46
  3 结果  46-50
  4 讨论  50-53
实验三应用变性梯度凝胶电泳探讨肠道菌群生物多样性  53-64
  1 材料  53-55
  2 方法  55-58
  3 结果  58-62
  4 讨论  62-64
小结  64-65
参考文献  65-76
个人简历和研究成果  76-77
致谢  77

IBD患者粪便菌群生物多样性及其主要组成的研究

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