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用人毛乳头细胞和角质形成细胞构建带附属器的组织工程皮肤替代物的实验研究

作　者: 焦虎
导　师: 范金财；陈光宇；刘立强
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 外科学
关键词: 毛乳头细胞角质形成细胞组织工程皮肤替代物毛囊
分类号: R751
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

实验研究(一)目的：寻求一种洁净无需显微镜下操作的毛乳头分离方法。方法：头皮组织用中性蛋白酶消化后,将含有毛囊下段的皮下脂肪层剪下切碎后,用Ⅰ型胶原酶消化,最后通过多次离心的方法获得毛乳头。结果：新型的两步酶消化法无需显微镜下操作,就可以获得洁净的毛乳头。结论：新型的两步酶消化法是一种高效的毛乳头分离方法。实验研究(二)目的：通过比较毛乳头细胞在含血清的角质形成细胞培养基(keratinocyte medium,KM)和普通培养基(normal medium, NM)中生物学特性差异来判断KM培养的毛乳头细胞是否可用于组织工程研究。方法：分别用角质形成细胞培养基和普通培养基培养毛乳头细胞,统计不同培养基中毛乳头贴壁率、细胞迁出时间、最大传代次数,镜下观察细胞形态差异,计数第3代细胞每皿聚集体个数,用MTT方法检.测细胞增殖,免疫荧光染色和特殊染色观察a-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)和ALP在两组细胞中的表达情况,并统计ALP蓝色阳性区域面积。结果：毛乳头在角质形成细胞培养基中贴壁率更高、细胞迁出更快,聚集生长能力更强,增殖迅速,可更多次持续传代,碱性磷酸酶的表达的持续代数更多。结论：用含血清的KM培养毛乳头细胞用于组织工程是可行的。实验研究(三)目的：用人毛乳头细胞和角质形成细胞做为种子细胞构建带附属器的组织工程皮肤替代物。方法：将角质形成细胞和毛乳头细胞共同混入胶原蛋白中制成真皮替代物,在此真皮替代物表面种上角质形成细胞形成复合组织工程皮肤替代物。将此皮肤替代物在气-液界面培养3-5天后移植到裸鼠背部创面,观察创面愈合情况和收缩情况,分别于移植后4、6、8周取标本做组织学观察。结果：用毛乳头细胞和角质形成细胞构建的皮肤替代物可以促进创面的愈合、基底膜的形成。移植后6周替代物内可见毛囊样结构和皮脂腺样结构。结论：将人的毛乳头细胞和角质形成细胞共同种植在皮肤替代物的真皮层可以构建出带附属器的组织工程皮肤替代物。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-10
文献综述  10-22
  1 皮肤及毛囊结构  10-11
    1.1 表皮层  10
    1.2 真皮层  10-11
    1.3 毛囊结构  11
  2 角质形成细胞和毛乳头细胞培养方法  11-14
    2.1 角质形成细胞的培养  11-13
      2.1.1 角质形成细胞的分离  11-12
      2.1.2 角质形成细胞培养方式  12
      2.1.3 角质形成细胞培养基  12-13
    2.2 毛乳头细胞的培养和鉴定  13-14
  3 组织工程皮肤替代物的构建现状  14-17
    3.1 表皮替代物  14-16
      3.1.1 单纯表皮细胞膜片  14-15
      3.1.2 带衬底的表皮细胞膜片  15-16
    3.2 真皮替代物  16
    3.3 复合皮肤替代物  16-17
  4 组织工程毛囊构建现状  17-22
    4.1 毛囊的体内构建  18-20
      4.1.1 皮丘法  18-19
      4.1.2 三明治法  19
      4.1.3 微小组织法  19-20
    4.2 用毛乳头细胞体外构建毛囊  20
    4.3 毛乳头细胞在组织工程皮肤中的应用  20-22
毛乳头细胞培养方法的探讨  22-27
  1 研究背景  22
  2 研究目的  22
  3 材料与方法  22-24
    3.1 主要试剂和仪器  22
    3.2 标本来源和处理  22
    3.3 毛乳头分离  22-23
    3.4 免疫荧光染色  23-24
    3.5 碱性磷酸酶染色  24
  4 结果  24-25
    4.1 毛乳头镜下观察  24
    4.2 细胞形态学观察  24
    4.3 α-SMA检测  24-25
    4.4 碱性磷酸酶检测  25
  5 讨论  25-27
角质形成细胞培养基培养毛乳头细胞的实验研究  27-32
  1 研究背景  27
  2 研究目的  27
  3 材料与方法  27-29
    3.1 主要试剂及仪器  27
    3.2 毛乳头细胞的分离培养  27-28
    3.3 检测指标  28
      3.3.1 毛乳头贴壁和细胞迁出检测  28
      3.3.2 细胞形态学观察  28
      3.3.3 细胞增殖检测  28
      3.3.4 免疫荧光染色观察  28
      3.3.5 ALP染色观察  28
    3.4 统计学方法  28-29
  4 结果  29-30
    4.1 毛乳头贴壁和细胞迁出比较  29
    4.2 细胞形态学观察  29
    4.3 细胞传代次数  29
    4.4 细胞增殖比较  29
    4.5 免疫荧光染色和ALP染色观察  29-30
  5 讨论  30-32
组织工程皮肤替代物的构建及移植  32-42
  1 研究背景  32
  2 研究目的  32
  3 材料和方法  32-36
    3.1 主要试剂  32-33
    3.2 毛乳头细胞的培养  33
    3.3 表皮细胞的培养  33
    3.4 新生鼠表皮细胞和真皮细胞的分离获得  33-34
      3.4.1 新生鼠表皮细胞的分离  33
      3.4.2 新生鼠真皮细胞的分离  33-34
    3.5 皮肤替代物的构建  34-35
      3.5.1 用人毛乳头细胞和表皮细胞构建皮肤替代物(实验组、对照组)  34
      3.5.2 用新生鼠真皮细胞和表皮细胞构建皮肤替代物(新生鼠组)  34-35
    3.6 皮肤替代物的移植  35
    3.7 移植后观察  35-36
      3.7.1 HE染色  35
      3.7.2 层粘连蛋白免疫组化染色  35-36
  4 结果  36-37
    4.1 实验组与对照组移植后大体观察  36
    4.2 新生鼠组移植后大体观察  36
    4.3 移植后实验组与对照组镜下观察  36-37
    4.4 移植后新生鼠组镜下观察  37
    4.5 皮肤替代物移植后基底膜的层粘连蛋白免疫组化染色  37
  5 讨论  37-42
全文总结  42-43
参考文献  43-54
附图  54-63
致谢  63-64
个人简历  64-65

用人毛乳头细胞和角质形成细胞构建带附属器的组织工程皮肤替代物的实验研究

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