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拟指数流加补料高密度培养重组E.coli产甲酸脱氢酶

作　者: 李丽
导　师: 岑沛霖；林建平
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 甲酸脱氢酶 高密度培养 指数流加 辅酶再生 醇脱氢酶 酶耦联
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


甲酸脱氢酶（Formate dedydrogenase,FDH）被认为是催化辅酶NADH高效再生的最佳酶选,绝大多数FDH是NAD-+依赖型,能专一性地把甲酸根氧化成CO2和H+,同时催化NAD+还原得到NADH。FDH构建的辅酶NADH再生体系,可与醇脱氢酶（Alcoholdedydrogenase,ADH）耦联,催化前手性酮不对称还原制备高价值的手性醇、手性氨基酸、手性羟基酸/酯等。利用重组大肠杆菌可以高效率表达FDH基因,但副产物乙酸的积累会影响细胞内FDH的积累,这一直是FDH生产一个亟待解决的问题。本工作的目的是建立拟指数流加补料高密度培养FDH重组大肠杆菌培养的发酵工艺,以副产物乙酸为关键控制点,优化工艺和补料策略,尽可能避免葡萄糖效应,减轻乙酸的抑制作用,提高FDH产量,缩短发酵周期,降低能源设备成本。并拟进一步研究FDH催化辅酶NADH体系的应用,将其与红串红球菌ADH组建耦联反应体系,催化4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）不对称还原生成（R）-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯（（R）-CHBE）,验证FDH催化辅酶NADH体系的应用可行性和效率。本文首先建立并验证了分阶段匀速流加补料模拟指数流加的方法,确定重组菌E.coliBL21（DE3）/pET 28a（+）-fdh的表观得率系数YX/S。在此基础上,重点研究了15 L发酵罐上FDH重组菌的拟指数流加补料高密度培养工艺。优化诱导时机、诱导前的补料策略和诱导后的比生长速率控制,以降低乙酸积累和提高FDH产量为主要调控指标。最终建立了批次发酵、诱导前流加补料和诱导后流加补料三阶段的培养模式,批次发酵结束后,采用比生长速率为0.05 h-1的拟指数流加补料策略,待生物量达到11.0 g DCW/L(OD600 25)后加入终浓度为0.4 mM的IPTG诱导,培养温度降为28℃。诱导后的比生长速率控制在0.08 h-1。pH控制在7.0。最终生物量为41.20 g DCW/L(OD600 114.8),FDH产量为26.24×103U/L,单位细胞干重FDH活力为636.9 U/g DCW。FDH的产量比批次发酵、诱导-补料（pH-stat法）两阶段法高密度培养提高了1.17倍,且大大缩短了发酵周期,节约成本。构建红串红球菌Rhodococcus erythropolis ATCC 17896的ADH重组菌E.coliBL21（DE3）/pET 28a（+）-adh,并优化了重组菌的诱导表达条件。组建ADH-FDH粗酶液耦联体系,催化COBE的不对称还原,（R）-CHBE的时空产率为7.125 mol/（L·h）,对映体过量率（e.e.）值89（±1.4）%,NADH的周转率为150 mol/mol。证明FDH催化甲酸钠再生NADH的体系是可行的,效率较高。

全文目录


致谢  6-7
摘要  7-8
Abstract  8-10
目录  10-13
第一章 引言  13-38
  1.1 甲酸脱氢酶  13-20
    1.1.1 NAD~+依赖型甲酸脱氢酶的结构  14-15
    1.1.2 NAD~+依赖型甲酸脱氢酶的催化性质  15-20
  1.2 甲酸脱氢酶催化的辅酶再生体系  20-24
    1.2.1 生物催化制备手性化合物  20
    1.2.2 辅酶再生  20-24
  1.3 高密度培养  24-32
    1.3.1 高密度培养的限制性因素  24-26
    1.3.2 流加补料策略  26-28
    1.3.3 减少乙酸积累的调控  28-32
    1.3.4 甲酸脱氢酶高密度培养生产现状  32
  1.4 4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原  32-36
  1.5 本课题拟研究的内容  36-38
    1.5.1 研究目的  36
    1.5.2 研究内容  36-38
第二章 实验材料与方法  38-48
  2.1 菌株与质粒  38
  2.2 工具酶与主要试剂  38-39
  2.3 实验仪器  39
  2.4 培养基  39-40
  2.5 实验操作及分析检测方法  40-48
    2.5.1 分子克隆相关实验操作  40
    2.5.2 pH和溶解氧检测  40
    2.5.3 大肠杆菌菌体密度检测方法  40
    2.5.4 大肠杆菌生物量检测方法  40
    2.5.5 葡萄糖浓度检测  40-41
    2.5.6 高效液相色谱法分析检测乙酸  41-42
    2.5.7 蛋白浓度检测  42-43
    2.5.8 甲酸脱氢酶酶活力检测  43-44
    2.5.9 红串红球菌醇脱氢酶活力检测  44-45
    2.5.10 COBE不对称还原的产物得率和对映体过量率分析  45-48
第三章 模拟指数流加方法的建立  48-53
  3.1 引言  48-49
  3.2 材料与方法  49
    3.2.1 实验菌株  49
    3.2.2 培养基与培养条件  49
    3.2.3 分析检测方法  49
  3.3 结果与讨论  49-52
    3.3.1 模拟指数流加方法的建立  49-51
    3.3.2 表观得率系数Y_(X/S)的测定  51-52
  3.4 小结  52-53
第四章 拟指数流加高密度培养工艺研究  53-68
  4.1 引言  53-54
  4.2 材料与方法  54
    4.2.1 实验菌株  54
    4.2.2 培养基与培养条件  54
    4.2.3 分析检测方法  54
  4.3 结果与讨论  54-66
    4.3.1 诱导时机的选择  55-57
    4.3.2 诱导前补料策略的优化  57-61
    4.3.3 诱导后不同比生长速率对乙酸积累和FDH产量的影响  61-66
  4.4 小结  66-68
第五章 NADH再生型双酶耦联体系的初步研究  68-85
  5.1 引言  68-69
  5.2 材料与方法  69-75
    5.2.1 菌株与质粒  69-71
    5.2.2 培养基与培养条件  71
    5.2.3 工具酶与主要试剂  71
    5.2.4 红串红球菌基因组的提取  71-72
    5.2.5 质粒的提取及转化  72
    5.2.6 红串红球菌ADH基因重组质粒的构建  72-73
    5.2.7 菌体培养与ADH的诱导表达  73
    5.2.8 SDS-PAGE检测重组蛋白ADH  73
    5.2.9 大肠杆菌菌体密度与ADH酶活力的检测  73-74
    5.2.10 ADH的分离纯化  74-75
    5.2.11 耦联体系的构建及COBE不对称还原  75
  5.3 结果与讨论  75-84
    5.3.1 红串红球菌ADH基因重组质粒的构建  75-77
    5.3.2 ADH的诱导表达及鉴定  77
    5.3.3 ADH诱导表达条件优化  77-80
    5.3.4 重组蛋白ADH的分离纯化  80-82
    5.3.5 耦联体系的构建及COBE不对称还原  82-84
  5.4 小结  84-85
第六章 结论与展望  85-88
  6.1 结论  85-87
  6.2 展望  87-88
参考文献  88-98
作者简历  98

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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