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光合细菌辅酶再生系统的研究及其在生物催化中的应用

作　者: 梁志华
导　师: 王梦亮
学　校: 山西大学
专　业: 微生物学
关键词: 类球红杆菌辅酶再生菌绿素载色体氢化酶氧化还原酶
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

近年来,用手性技术不对称催化合成手性化合物及其手性中间体已经引起了学术界和企业界的重视,成为研究开发的热点。利用生物不对称催化具有反应条件温和、转化率高及立体选择性好等优点,已经成了诸多手性合成方法的首选。氧化还原酶是在生物催化手性合成中起着重要应用的一类酶。大部分氧化还原酶的催化反应需要辅酶NADPH作为还原剂参与,由于氧化还原酶应用广泛而NADPH价格昂贵,因此NADPH的再生在生物催化中起着重要的作用。另一方面,辅酶NADPH的再生能简化产物的分离,促使反应向正反应方向移动。现已有的NADPH再生方法包括酶法,电化学以及光化学方法等等。本论文是在前期以整体细胞不对称生物催化的基础上研究NADPH的再生,主要是以光合细菌作为实验材料,通过提取菌绿素、载色体,分离纯化氢化酶、氧化还原酶,构建了四种辅酶再生体系,以期实现在生物不对称催化中能够进行NADPH的再生,从而为辅酶依赖性的生物催化体系提供理论基础和方法指导。其主要内容如下：(1)从类球红杆菌中提取出的菌绿素作为光敏剂光解水从而实现辅酶NADPH的再生,通过对再生体系所必需的条件实验,分析了利用菌绿素进行辅酶再生的机理,并且考察了辅酶再生的各个因素,得出再生NADPH的最佳条件为：pH 7.0,温度为35℃,NADP+的初始浓度为50μmol/L,反应的最佳时间12 h,电子供体和氢供体的浓度分别为10 mmol/L和10 mmol/L(2)从类球红杆菌其提取出的载色体通过光电子传递链实现辅酶NADPH的再生。通过对再生体系所必需的条件实验,分析了利用载色体进行辅酶再生的机理。并且考察了辅酶再生的各个因素,得出再生NADPH的最佳条件为：pH7.0,温度为35℃,NADP+的初始浓度为50μmol/L,反应的最佳时间12h,电子供体和氢供体的浓度分别为10 mmol/L和10 mmol/L。(3)从类球红杆菌中分离纯化出的氢化酶催化氢气产生电子和氢质子,从而实现辅酶NADPH的再生。通过对再生体系所必需的条件实验,分析了利用氢化酶进行辅酶再生的机理。并且考察了辅酶再生的各个因素,得出再生NADPH的最佳条件为：pH7.0,温度为30℃,NADP+的初始浓度为50μmol/L,反应的最佳时间3h。(4)从类球红杆菌中分离纯化的氧化还原酶共底物催化,从而实现辅酶NADPH的再生。通过对再生体系所必需的条件实验,分析了利用氧化还原酶进行辅酶再生的机理。并且考察了辅酶再生的各个因素,得出再生NADPH的最佳条件为：pH 7.5,温度为30℃,NADP+的初始浓度为501μmol/L,反应的最佳时间3h,葡萄糖和ATP的浓度分别为4.5g/L和11.5g/L(5)通过对不同的芳香酮类、脂肪酮化合物为底物进行了酶法还原,检测其反应的还原产率和e.e值,结果表明该酶催化的底物适用范围很广；酶对电负性强的基团在苯乙酮α位取代的衍生物以及五碳脂肪酮的专一性较强；酶催化的立体选择性都在9996以上,具有极高的立体选择性。

全文目录

中文摘要  11-13
ABSTRACT  13-16
第一章:引言  16-26
  1.1 光合细菌的概述  16-20
    1.1.1 光合细菌的分布及其发展史  16
    1.1.2 光合细菌的分类及其生理生化特点  16-18
    1.1.3 光合细菌的理论价值及其应用  18-20
    1.1.4 光合细菌发展的前景展望和存在问题  20
  1.2 辅酶再生的意义、原理和研究进展、辅酶再生的方法  20-24
    1.2.1 辅酶再生在生物催化研究中的重要性  20-21
    1.2.2 辅酶再生原理及方法  21-24
  1.3 本课题研究的目的和主要内容  24-26
第二章:利用光合细菌菌绿素进行辅酶再生的研究  26-34
  2.1 材料与方法  26-28
    2.1.1 实验材料  26
    2.1.2 实验仪器  26-27
    2.1.3 实验方法  27-28
  2.2 结果与讨论  28-33
    2.2.1 还原态辅酶(NADPH)的标准曲线  28-29
    2.2.2 利用菌绿素进行辅酶再生体系的机理实验  29-30
    2.2.3 利用菌绿素进行辅酶再生体系条件优化结果分析  30-33
      2.2.3.1 氧化态辅酶的浓度对辅酶再生的影响  30
      2.2.3.2 pH对辅酶再生的影响  30-31
      2.2.3.3 温度对辅酶再生的影响  31
      2.2.3.4 不同时间条件下辅酶的收率  31-32
      2.2.3.5 电子供体和氢供体对辅酶再生的影响  32-33
  2.3 结论  33-34
第三章利用光合细菌的载色体进行的辅酶再生  34-41
  3.1 材料与方法  34-36
    3.1.1 实验材料  34
    3.1.2 实验仪器  34
    3.1.3 实验方法  34-36
  3.2 结果与讨论  36-40
    3.2.1 利用载色体进行辅酶再生体系的机理实验  36-37
    3.2.2 利用载色体进行辅酶再生体系条件优化结果分析  37-40
      3.2.2.1 氧化态辅酶的浓度对辅酶再生的影响  37-38
      3.2.2.2 pH对辅酶再生的影响  38
      3.2.2.3 温度对辅酶再生的影响  38-39
      3.2.2.4 不同时间条件下辅酶的转化率  39
      3.2.2.5 电子供体和氢供体对辅酶再生的影响  39-40
  3.3 结论  40-41
第四章利用光合细菌氢化酶进行辅酶再生的研究  41-47
  4.1 材料与方法  41-42
    4.1.1 菌种、试剂和仪器  41
    4.1.2 类球红杆菌的培养及其氢化酶的分离纯化  41
    4.1.3 还原态辅酶NADPH的检测方法  41
    4.1.4 氢化酶的酶活分析  41-42
    4.1.5 利用氢化酶进行辅酶再生体系的构建  42
    4.1.6 利用氢化酶进行辅酶再生体系条件的研究  42
  4.2 结果与讨论  42-46
    4.2.1 分离纯化的氢化酶  42-43
    4.2.2 酶的纯度检测及分子量  43
    4.2.3 利用氢化酶进行辅酶再生体系的机理实验  43-44
    4.2.4 利用氢化酶进行辅酶再生体系条件优化结果分析  44-46
      4.2.4.1 氧化态辅酶的浓度对辅酶再生的影响  44-45
      4.2.4.2 pH对辅酶再生的影响  45
      4.2.4.3 温度对辅酶再生的影响  45-46
      4.2.4.4 不同时间条件下辅酶的转化率  46
  4.3 结论  46-47
第五章利用光合细菌氧化还原酶进行辅酶再生  47-54
  5.1 材料与方法  47-48
    5.1.1 实验材料  47
    5.1.2 实验方法  47-48
  5.2 结果与讨论  48-53
    5.2.1 分离纯化的氧化还原酶  48-49
    5.2.2 酶的纯度检测及分子量  49
    5.2.3 利用氧化还原酶进行辅酶再生体系的机理实验  49-50
    5.2.4 利用氧化还原酶进行辅酶再生体系条件优化结果分析  50-53
      5.2.4.1 氧化态辅酶的浓度对辅酶再生的影响  50-51
      5.2.4.2 pH对辅酶再生的影响  51
      5.2.4.3 温度对辅酶再生的影响  51-52
      5.2.4.4 不同时间条件下辅酶的转化率  52
      5.2.4.5 葡萄糖和ATP浓度对辅酶再生的影响  52-53
  5.3 结论  53-54
第六章:光合细菌辅酶再生系统在生物催化中的应用  54-58
  6.1 材料与方法  54-55
    6.1.1 实验材料  54
    6.1.2 实验方法  54-55
      6.1.2.1 不同辅酶再生体系与催化体系偶合反应的构建  54
      6.1.2.2 不同底物在偶合催化体系中的研究  54-55
  6.2 结果与讨论  55-56
    6.2.1 辅酶再生体系与催化体系的偶合反应  55
    6.2.2 辅酶NADPH再生体系与催化体系偶合不对称还原  55-56
  6.3 结论  56-58
参考文献  58-65
附录  65-66
  攻读硕士学位期间发表和待发表的论文  65-66
致谢  66-67
个人简况及联系方式  67-70

光合细菌辅酶再生系统的研究及其在生物催化中的应用

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