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马肝醇脱氢酶基因的克隆表达及活性测定

作　者: 韩云波
导　师: 张怡轩；陈代杰
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 马肝醇脱氢酶 克隆表达 蛋白纯化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 25次
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内容摘要


本研究应用RT-PCR方法,从马肝中扩增了两种马肝醇脱氢酶同工酶基因(hladh-e和hladh-s),并先后将其克隆到大肠杆菌表达载体pET30a、pET20b(+)、pkk223-3、pTrc99a上,进行表达研究。对菌体内表达的两种马肝醇脱氢酶同工酶(HLADH-E、HLADH-S)的活性进行了研究。另外,由于本研究克隆的基因来源于马肝,所以尝试将两基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,在酵母中进行了马肝醇脱氢酶基因表达的初步探索。将扩增得到的hladh-e和hladh-s通过同源性比较发现,它与文献报道的hladh-e和hladh-s序列存在一个碱基的差异,但是氨基酸序列分析结果表明与文献报道的序列一致。将该基因先后克隆到各种表达载体上,构建成一系列重组质粒pLY105E/S、pLY106E/S、pLY107E/S、pLY108E/S、pLY109E/S、pLY11OE/S和pLY115E/S。对这些重组质粒进行表达研究,结果表明在E.coli BL21 (DE3) pLY109E/S中表达的重组蛋白HLADH-E/S可溶性效果最好。当菌体在LB培养基中于30℃振荡培养到OD600大约0.6时,用终浓度lmmol的IPTG诱导4h,可获得HLADH-E/S的高效表达。HLADH-E/S产量占菌体可溶蛋白的20%左右。对菌体的可溶性部分进行了处理,用镍柱纯化HLADH-E/S.对纯化后的HLADH-E/S活性进行研究,通过实验确定了最佳的反应温度、时间、底物浓度和辅酶浓度。该酶纯化后活力达到1.04×103U／mg,有望应用于工业化生产。

全文目录


摘要  10-11
ABSTRACT  11-12
英文缩写说明  12-13
第一章 前言  13-20
  1.1 醇脱氢酶研究概况  13-14
    1.1.1 醇脱氢酶概况  13-14
    1.1.2 醇脱氢酶的应用  14
  1.2 马肝醇脱氢酶研究概况  14-19
    1.2.1 马肝醇脱氢酶的性质  14-15
    1.2.2 马肝醇脱氢酶的氧化还原反应过程  15
    1.2.3 马肝醇脱氢酶的生物学功能  15-17
    1.2.4 研究意义及国内外现状分析  17-19
  1.3 立题依据  19-20
第二章 马肝醇脱氢酶基因在E.COLI中的克隆表达  20-42
  2.1 材料  20-23
    2.1.1 化学药品和生化试剂  20-21
      2.1.1.1 酶  20
      2.1.1.2 生化试剂  20-21
      2.1.1.3 培养基组分  21
    2.1.2 菌种和质粒  21-22
      2.1.2.1 菌种  21-22
      2.1.2.2 质粒  22
    2.1.3 培养基配方  22
    2.1.4 所用的缓冲液  22-23
    2.1.5 仪器设备  23
  2.2 试验方法  23-29
    2.2.1 菌种的培养和保藏  24
    2.2.2 碱变性法微量制备质粒  24
    2.2.3 E.coli质粒的纯化  24
    2.2.4 DNA片段凝胶回收(V-gene DNA Gel Extraction Kit)  24-25
    2.2.5 质粒DNA的酶切  25
    2.2.6 质粒与外源片段的连接  25
    2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法)  25-26
    2.2.8 大肠杆菌质粒的转化  26
    2.2.9 PCR扩增  26
    2.2.10 RT-PCR反应  26-27
    2.2.11 马肝总RNA的提取  27
    2.2.12 马肝醇脱氢酶基因亚克隆的构建  27-28
    2.2.13 马肝醇脱氢酶基因工程菌的构建  28
    2.2.14 诱导表达  28
    2.2.15 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  28-29
    2.2.16 对重组表达产物的初步活性测定  29
  2.3 结果与讨论  29-40
    2.3.1 马肝总RNA的抽提  29
    2.3.2 马肝醇脱氢酶基因的克隆  29-31
    2.3.3 马肝醇脱氢酶基因的测序  31
    2.3.4 马肝醇脱氢酶基因表达载体pLY105E/S的构建  31-33
    2.3.5 马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY105E/S的诱导表达分析  33-34
    2.3.6 其它引物的设计  34-35
    2.3.7 马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY107E/S、pLY108E/S、pLY109E/S、pLY110E/S和pLY115E/S的构建  35-38
      2.3.7.1 马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY107E/S的构建  35
      2.3.7.2 马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY108E/S的构建  35-37
      2.3.7.3 马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY109E/S、pLY110E/S的构建  37
      2.3.7.4 马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY115E/S的构建  37-38
    2.3.8 马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY107E/S、pLY108E/S、pLY109E/S、pLY110E/S和pLY115E/S的诱导表达  38-40
  2.4 结论  40-41
  2.5 讨论  41-42
第三章 重组马肝醇脱氢酶活性研究  42-50
  3.1 材料  42-43
    3.1.1 试剂  42
    3.1.2 溶液配制  42-43
    3.1.3 仪器设备  43
  3.2 方法  43-46
    3.2.1 培养菌体  43
    3.2.2 破碎菌体制备  43
    3.2.3 酶催化反应的进行  43
    3.2.4 重组马肝醇脱氢酶的亲和纯化  43-44
      3.2.4.1 粗酶液制备  44
      3.2.4.2 亲和层析  44
    3.2.5 BCA法测定蛋白质浓度  44
    3.2.6 NADH标准曲线的绘制及马肝醇脱氢酶活力的测定  44-45
      3.2.6.1 NADH标准曲线的绘制  44-45
      3.2.6.2 马肝醇脱氢酶活力的测定方法  45
    3.2.7 温度对马肝醇脱氢酶活力的影响  45
    3.2.8 pH对马肝醇脱氢酶活力的影响  45
    3.2.9 金属离子和EDTA对马肝醇脱氢酶活力的影响  45
    3.2.10 米氏常数的测定  45-46
  3.3 结果  46-49
    3.3.1 重组马肝醇脱氢酶纯化结果  46
    3.3.2 BCA法测定蛋白质浓度结果  46-47
    3.3.3 NADH标准曲线的绘制  47
    3.3.4 温度对马肝醇脱氢酶活力的影响  47
    3.3.5 pH对马肝醇脱氢酶活力的影响  47-48
    3.3.6 金属离子对马肝醇脱氢酶活力的影响  48
    3.3.7 米氏常数的测定  48-49
  3.4 结论  49-50
第四章 在毕赤酵母中表达马肝醇脱氢酶的初步研究  50-64
  4.1 材料  50-52
    4.1.1 菌种和质粒  50
      4.1.1.1 菌种  50
      4.1.1.2 质粒  50
    4.1.2 试剂  50-51
      4.1.2.1 生化试剂  50-51
      4.1.2.2 培养基成分  51
    4.1.3 培养基  51-52
      4.1.3.1 培养基原液  51
      4.1.3.2 培养基  51-52
    4.1.4 所用溶液及缓冲液  52
    4.1.5 主要的实验仪器  52
  4.2 实验方法  52-57
    4.2.1 酵母菌株的保存  52-53
    4.2.2 酵母菌株的分离纯化  53
    4.2.3 毕赤酵母表达系统的实验方法  53-57
      4.2.3.1 线性化质粒DNA的脱磷酸化处理  53
      4.2.3.2 酵母电转化感受态细胞的制备  53-54
      4.2.3.3 电击转化  54
      4.2.3.4 Mut+型和Muts型转化子的筛选  54
      4.2.3.5 直接用菌落PCR方法鉴定转化子  54-55
      4.2.3.6 毕赤酵母总DNA提取方法  55-56
      4.2.3.7 用毕赤酵母总DNA进行PCR检测  56
      4.2.3.8 Mut+型重组酵母的诱导表达  56-57
  4.3 结果  57-62
    4.3.1 表达质粒的构建和鉴定  57-60
    4.3.2 电击转化  60
    4.3.3 阳性克隆的筛选和鉴定  60-62
      4.3.3.1 pLY106E和pLY106S的PCR扩增结果  60-61
      4.3.3.2 pLY106E和pLY106S的PCR扩增结分析  61-62
    4.3.4 阳性克隆在毕赤酵母中表达  62
  4.4 结论  62
  4.5 讨论  62-64
第五章 全文总结  64-65
参考文献  65-68
附录1 PCR产物测序结果  68-72
致谢  72-73
个人简历  73

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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