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Ⅳ型HEV real-time RT-PCR方法的建立及重组病毒样颗粒抗原的真核表达

作　者: 贾鹏
导　师: 金宁一
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: ORF2基因 TaqMan real-time RT-PCR方法 抗原表位 病毒样颗粒 毕赤酵母
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本研究针对基因Ⅳ型HEV基因组ORF3设计特异性的引物和探针,建立了从猪粪便中定量检测基因Ⅳ型HEV的real-time RT-PCR方法。该方法标准曲线的相关系数和斜率分别为0.994和-3.312,并且具有较好的重复性、特异性和灵敏性。所建立的real-time RT-PCR方法能够准确的从阳性基因Ⅳ型HEV毒株中检测到病毒核酸。为基因Ⅳ型戊型肝炎病毒的分子生物学检测奠定基础。在参考相关文献的基础上,通过生物信息学软件分析了基因Ⅳ型HEV CH-S-1毒株基因序列和氨基酸序列,结果表明基因Ⅳ型HEV CH-S-1毒株与CH-87毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为92.5%和100%。基因进化树分析结果发现CH-S-1毒株与CH-87毒株在同一分支上,属于基因Ⅳ型Ⅳa亚型。HEV优势抗原表位的预测结果表明HEV ORF2 424~563aa和613~674aa区段绝大部分位于该蛋白表面,而235~372aa区段有部分包裹在所分析蛋白内部。因此本研究初步将ORF2蛋白382~674aa区域(p293)作为HEV优势抗原表位相对集中的区域做进一步研究。通过设计特异性的引物,扩增了ORF2基因截短体293(6286bp~7167bp)并且成功构建了毕赤酵母分泌表达重组质粒pPIC9K-293。重组菌经Muts表型筛选和PCR鉴定后,成功筛选到了阳性重组酵母菌GS115/pPIC9k-293。目的蛋白SDS-PAGE的检测结果可见与预期大小一致的目的带,目的蛋白p293占培养物上清中可溶蛋白的15.7%。Western Blot结果表明目的蛋白具有较好的抗原性。在对诱导表达条件优化后发现,目的蛋白的表达量显著提高。硫酸铵沉淀、透析纯化浓缩目的蛋白,SDS-PAGE分析表明,纯化浓缩后的目的蛋白占总蛋白的85%,约为80mg/L。在透射电镜下观察目的蛋白p293,可见大小为30nm左右的病毒样颗粒。研究结果为HEV血清学诊断方法以及疫苗的相关研究奠定了基础。

全文目录


内容提要  4-8
绪论  8-10
第一篇 文献综述  10-42
  1.1 HEV 生物学特性  10-19
    1.1.1 HEV 研究史  10-12
    1.1.2 HEV 理化特性  12-13
    1.1.3 HEV 分类  13
    1.1.4 HEV 基因结构  13-16
    1.1.5 HEV 基因型  16-18
    1.1.6 HEV 遗传与变异  18-19
  1.2 戊型肝炎流行病学  19-22
    1.2.1 传染源  19-22
    1.2.2 传播途径  22
    1.2.3 易感人群  22
  1.3 戊型肝炎流行状况及其影响因素  22-24
  1.4 临床症状及病理变化  24-27
    1.4.1 影响HEV 致病力的因素  24-25
    1.4.2 戊型肝炎临床症状及病理变化  25-27
  1.5 戊型肝炎免疫学反应  27-28
  1.6 戊型肝炎人兽共患性质  28-32
    1.6.1 HEV 在人和家猪间的传播  28-30
    1.6.2 HEV 在人和野生动物间的传播  30-31
    1.6.3 HEV 在人和猫间的传播  31
    1.6.4 HEV 在人和其他动物间的传播  31-32
    1.6.5 HEV 在人和动物跨种间实验性感染  32
  1.7 戊型肝炎的诊断方法  32-39
    1.7.1 HEV 抗原表位分析  33-35
    1.7.2 戊型肝炎的诊断  35-39
  1.8 HEV 的培养、复制和表达  39-40
    1.8.1 细胞培养体系  39
    1.8.2 HEV 体外拯救  39-40
    1.8.3 复制与表达  40
  1.9 HEV 的预防  40-42
第二篇 研究内容  42-100
  第1章 基因Ⅳ型HEV real-time RT-PCR方法的建立  42-60
    1.1 材料与方法  42-50
    1.2 结果  50-56
    1.3 讨论  56-58
    1.4 小结  58-60
  第2 章 HEV CH-S-1 株抗原表位基因的筛选及其克隆与鉴定  60-79
    2.1 材料与方法  60-67
    2.2 结果  67-75
    2.3 讨论  75-78
    2.4 小结  78-79
  第3章 HEV抗原表位基因在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定  79-100
    3.1 材料与方法  79-88
    3.2 结果  88-94
    3.3 讨论  94-98
    3.4 小结  98-100
结论  100-101
参考文献  101-118
攻读学位期间发表的学术论文  118-119
致谢  119-120
中文摘要  120-123
英文摘要  123-125

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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