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动物源性食品中氯霉素快速检测的ELISA方法研究

作　者: 杨丽丽
导　师: 高志贤
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 氯霉素 多克隆抗体 酶联免疫吸附分析 残留 试剂盒 酶标抗原
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


氯霉素（CAP）是一种高效的抗生素,它可以和大多数药物和饲料添加剂混用,在使用过程中稳定,药效不会降低。由于该药物的广泛使用,使其在动物源性食品中的检出率越来越高,许多发达国家相继禁止或严格限制使用氯霉素,但传统的氯霉素残留分析方法需要昂贵的仪器和专业技术人员,且周期长、成本高,不能满足现场和快速检测的要求,建立高效、灵敏、经济的氯霉素残留分析方法是很有必要的。因此,研究用于检测氯霉素的ELISA试剂盒用于食品安全检测,对于保护消费者利益,以及在国际贸易中有重要的意义。本研究对氯霉素人工抗原的合成、抗体的纯化以及ELISA检测方法的建立和优化等进行了研究。采用活性酯法和重氮化法,将半抗原氯霉素与小牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联,经紫外光谱、红外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定证明半抗原与载体蛋白偶联成功。运用合成的免疫原（Hap-BSA）多次免疫动物,采集抗血清,制备出氯霉素多克隆抗体,经ELISA法测定抗体效价可达到1:1000000。采用饱和硫酸铵分级沉淀法对采集的抗血清进行初级分离,后利用自制的免疫亲和层析柱对IgG粗品进一步进行亲和层析纯化,可获得高纯度高特异性的兔抗氯霉素抗体。通过比较不同的酶标记方法,选用混合酸酐法合成酶标半抗原,并用ELISA法确定了偶联后HRP的活性。通过对包被缓冲液、洗涤次数、包被温度、时间、减少非特异性吸附的方法等的筛选,优化了固相抗体-酶标抗原直接竞争酶联免疫分析方法。确定以0.05mol/L pH9.6的CBS缓冲液作为包被酶标板的抗体稀释缓冲液,以0.01mol/L pH7.4 PBS溶液作为酶标抗原的稀释液,以1.0%OVA的PBS溶液作为封闭液,固相包被条件为37℃2h最佳。利用优化后的分析条件和酶标半抗原采用直接竞争ELISA法进行抗体亲和性和特异性研究。通过方阵试验及筛选得到优化浓度组合为:抗体28.30μg/ml、酶标半抗原5.36μg/ml。氯霉素在0.2-64ng/ml浓度范围内,抑制率与浓度呈线性关系,回归方程为y=-14.84310gx+56.692,R2=0.9965,IC50=2.82ng/ml,IC10=0.451ng/ml。与其他类抗生素无明显的交叉反应。实验中确定了对鸡肉,牛奶和新鲜虾肉中氯霉素的提取方法,据此构建的ELISA试剂盒可用于样品中氯霉素的快速检测。样品的添加回收率范围在72.6%-113.6%之间,变异系数在4.26%-17.75%之间。试剂盒性能测试结果表明,其准确性和重现性较好,储存期试验表明试剂盒在4℃下可保存4个月。可用于虾肉,鸡肉,牛奶等样品中氯霉素残留的批量快速,廉价的检测。

全文目录


摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
缩略词表  13-14
第一章 前言  14-27
  1 氯霉素简介  14-20
    1.1 氯霉素药物概况  14-15
      1.1.1 氯霉素的理化性质  14
      1.1.2 氯霉素作用机理  14-15
      1.1.3 氯霉素作用范围  15
    1.2 氯霉素残留现状  15-16
    1.3 氯霉素检测方法现状  16-20
      1.3.1 微生物法  16
      1.3.2 免疫法  16-17
        1.3.2.1 酶联免疫法  17
        1.3.2.2 放射免疫法  17
      1.3.3 色谱法  17-19
        1.3.3.1 高效液相色谱法  17-18
        1.3.3.2 气相色谱法  18
        1.3.3.3 气质联用法  18-19
        1.3.3.4 液质联用法  19
      1.3.4 各种检测方法的比较  19-20
  2 小分子药物酶联免疫分析的研究方法  20-25
    2.1 半抗原  21
    2.2 人工抗原  21-23
      2.2.1 偶联方式的选择  22
      2.2.2 人工抗原纯化及鉴定  22-23
    2.3 抗体的制备与纯化  23-25
      2.3.1 抗体的制备  23-24
      2.3.2 抗体纯化  24-25
    2.4 抗原或抗体的标记  25
  3 立题依据  25-27
第二章 氯霉素免疫原及包被原的研制  27-36
  1 材料与方法  27-30
    1.1 材料  27-28
      1.1.1 主要试剂  27
      1.1.2 主要仪器  27-28
    1.2 方法  28-30
      1.2.1 活性酯法合成氯霉素免疫原和包被原  28
      1.2.2 重氮化法合成氯霉素免疫原和包被原  28
      1.2.3 半抗原-偶联物(Hap-BSA和Hap-OVA)的鉴定  28-30
  2 结果与分析  30-35
    2.1 合成的氯霉素全抗原的紫外光谱分析  30-32
    2.2 合成的氯霉素全抗原合成效果的红外结果分析  32-34
    2.3 氯霉素全抗原纯度测定结果分析  34-35
  3 小结  35-36
第三章 氯霉素多克隆抗体的制备与纯化  36-47
  1 材料与方法  36-41
    1.1 材料  36-37
      1.1.1 主要试剂  36
      1.1.2 主要仪器  36
      1.1.3 缓冲液体系  36-37
      1.1.4 其他材料  37
    1.2 实验方法  37-41
      1.2.1 动物免疫  37-39
        1.2.1.1 试验动物准备  37
        1.2.1.2 免疫原的制备  37-38
        1.2.1.3 动物免疫  38-39
      1.2.2 抗体的初步纯化  39
        1.2.2.1 饱和硫酸铵初级沉淀  39
        1.2.2.2 SDS-PAGE法检测蛋白纯度  39
      1.2.3 亲和层析柱的制备  39-40
        1.2.3.1 间隔臂的偶联  39-40
        1.2.3.2 氯霉素的活化  40
        1.2.3.3 氯霉素亲和凝胶的的制备  40
        1.2.3.4 偶联率的计算  40
        1.2.3.5 装柱  40
      1.2.4 抗体的亲和层析纯化及蛋白浓度纯度检测  40-41
      1.2.5 抗体效价评价测定  41
      1.2.6 抗体的特异性试验  41
      1.2.7 交叉反应率的测定  41
  2 结果与分析  41-46
    2.1 抗体效价测定  41-42
    2.2 抗氯霉素特异性多克隆抗体的初步纯化  42
    2.3 免疫亲和层析柱的制备  42-43
    2.4 亲和层析结果  43
    2.5 亲和层析特异性洗脱中蛋白质含量的变化  43-45
    2.6 抗体的效价试验  45
    2.7 抗体的特异性试验  45-46
    2.8 交叉反应  46
  3 小结  46-47
第四章 直接竞争ELISA方法的建立与优化  47-65
  1 材料与方法  47-54
    1.1 材料  47-48
      1.1.1 主要试剂  47
      1.1.2 主要仪器  47
      1.1.3 缓冲液体系  47-48
    1.2 方法  48-54
      1.2.1 酶标半抗原的制备  48
      1.2.2 酶标半抗原的活性鉴定  48-49
      1.2.3 ELISA方法的建立  49
      1.2.4 ELISA方法条件的优化  49-51
        1.2.4.1 包被缓冲液的选择  49
        1.2.4.2 洗涤条件优化  49-50
        1.2.4.3 封闭条件优化  50
        1.2.4.4 包被温度和时间的确定  50
        1.2.4.5 抗体-酶标氯霉素工作浓度优化  50
        1.2.4.6 标准曲线的建立  50-51
      1.2.5 抗体亲和性及检测灵敏度  51
      1.2.6 抗体的特异性  51
      1.2.7 方法的准确性试验  51-52
      1.2.8 样品加标回收率试验  52-54
        1.2.8.1 标准溶液的配制  52
        1.2.8.2 不同溶剂对抗原抗体结合反应的影响  52
        1.2.8.3 样品前处理  52-53
        1.2.8.4 样品基质影响试验  53
        1.2.8.5 加标回收率测定以及与商品化试剂盒的比较  53
        1.2.8.6 高效液相色谱法验证试验准确性  53-54
      1.2.9 保存期试验  54
        1.2.9.1 冻融试验  54
        1.2.9.2 4℃和-20℃试剂盒保存期试验  54
  2 结果与分析  54-63
    2.1 酶标半抗原的活性鉴定  54-55
    2.2 ELISA方法条件的建立和优化  55-57
      2.2.1 包被缓冲液的选择  55
      2.2.2 洗涤次数对洗涤效果的影响  55-56
      2.2.3 不同封闭物对非特异性吸附的影响  56
      2.2.4 包被温度和时间的选择和确定  56
      2.2.5 抗体-酶标氯霉素工作浓度优化  56-57
    2.3 抗体亲和性及检测灵敏度  57-58
      2.3.1 标准曲线的建立  57
      2.3.2 抗体亲和性及检测灵敏度  57-58
      2.3.3 不同溶剂对抗原抗体结合反应的影响  58
    2.4 抗体的特异性  58-59
    2.5 方法的准确性  59
    2.6 样品加标回收率  59-62
      2.6.1 样品基质影响试验  59-60
      2.6.2 样品加标回收率以及与商用试剂盒的比较  60
      2.6.3 高效液相色谱法验证试验准确性  60-62
    2.7 保存期试验结果  62-63
      2.7.1 酶标半抗原和包被抗体酶标板的冻融试验结果  62
      2.7.2 4℃和-20℃保存期试验  62-63
  3 小结  63-65
第五章 结论与讨论  65-68
  1 氯霉素免疫原和包被原的合成  65-66
  2 抗体的制备与纯化  66
  3 酶标抗原的制备  66-67
  4 直接竞争ELISA方法的建立与优化  67-68
参考文献  68-73
致谢  73-74
附录  74

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医药物学 > 兽医毒物学 > 动物性食品中化学物残留
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