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β-胡萝卜素产生菌的选育及其发酵条件的优化

作　者: 韩梅
导　师: 张伟国
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 锁掷酵母 β-胡萝卜素液质联用固态发酵
分类号: R151
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文根据代谢工程的基本原理对锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）JD-2（实验室保藏菌株）,进行逐级诱变处理,最终获得一株β-胡萝卜素高产菌JD-2-8。然后对其固态和液态发酵条件进行了优化,并分析了其应用前景。主要研究内容和结论如下:（1）以本实验室保藏菌JD-2为出发菌株,经过紫外线（UV）、微波（MV）和硫酸二乙酯（DES）逐级诱变处理,以二苯胺抗性平板进行定向筛选,并结合菌落颜色的深浅最终选育出一株β-胡萝卜素高产菌。在未经优化的条件下总类胡萝卜素含量由0.21 mg/g干菌体提高到0.57 mg/g干菌体。（2）对锁掷酵母中的各种类胡萝卜素用薄板层析、液相色谱、液质联用和光谱分析等方法进行定量定性分析,最终得出锁掷酵母中主要类胡萝卜素成分为β-胡萝卜素、红酵母红素、红酵母烯和γ-胡萝卜素,β-胡萝卜素中全反式结构占60%左右。（3）对β-胡萝卜素液态发酵条件进行优化得到其最佳培养基组成为葡萄糖80 g/L,玉米浆19.92 g/L,KH₂PO₄ 0.96 g/L,MgSO₄·7H₂O 0.54 g/L;最适pH6.0,最适温度28℃。相对溶氧控制策略为0-16 h溶氧控制在20-30%;16-72 h为0-5%。优化后菌体得率为56.32 g/L,总类胡萝卜素产量为31.07 mg/L,β-胡萝卜素产量可达18.92 mg/L,占总类胡萝卜素量的60.43 %。（4）对固态发酵条件进行优化,最佳物料比例为玉米面:豆粕:啤酒糟=4:1:1,最佳发酵条件如下:培养基最适含水量为44.4%,最适装料量为30 g/250 mL三角瓶,发酵时间108 h,总类胡萝卜素产量为54.51 mg/kg干物料,β-胡萝卜素为27.01 mg/kg干物料。最后分析了固态发酵中该酵母的类胡萝卜素、氨基酸和有机酸组成,分析了其作为饲料酵母的可行性。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章引言  7-13
  1.1 类胡萝卜素概述  7-8
    1.1.1 类胡萝卜素名称的由来  7
    1.1.2 类胡萝卜素在自然界中的存在形式  7
    1.1.3 β-胡萝卜素的结构  7-8
  1.2 β-胡萝卜素的生产方法  8
    1.2.1 化学合成法  8
    1.2.2 盐藻发酵法  8
    1.2.3 三孢布拉霉（Blakeslea trispora）发酵法  8
    1.2.4 酵母发酵法  8
  1.3 β-胡萝卜素在酵母中的合成途经  8-9
  1.4 β-胡萝卜素的生理功能及应用  9-10
  1.5 β-胡萝卜素作为增色饲料添加剂的研究进展  10-11
  1.6 各种产β-胡萝卜素酵母菌株的选育进展  11-12
  1.7 本课题研究的意义及主要内容  12-13
第二章实验材料与方法  13-19
  2.1 实验材料  13-14
    2.1.1 实验菌株  13
    2.1.2 实验试剂  13
    2.1.3 实验仪器  13
    2.1.4 培养基  13-14
  2.2 实验方法  14-19
    2.2.1 培养方法  14
    2.2.2 诱变方法  14-15
    2.2.3 平板筛选方法  15
    2.2.4 摇瓶筛选方法  15
    2.2.5 锁掷酵母破壁方法  15-16
    2.2.6 β-胡萝卜素萃取剂的选择方法  16
    2.2.7 分析方法  16-17
    2.2.8 β-胡萝卜素产量的表示方法  17-19
第三章结果与讨论  19-42
  3.1 锁掷酵母的诱变育种  19-22
    3.1.1 菌体生长曲线和比生长曲线的测定  19
    3.1.2 诱变时间的确定  19-20
    3.1.3 β-胡萝卜素产生菌的选育谱系  20
    3.1.4 β-胡萝卜素产生菌的选育结果  20-22
  3.2 锁掷酵母中类胡萝卜素的提取方法的研究  22-23
    3.2.1 锁掷酵母破壁方法的选择  22
    3.2.2 萃取剂及比例的选择  22-23
  3.3 β-胡萝卜素的定性定量分析  23-26
    3.3.1 薄板层析结果  24
    3.3.2 高效液相色谱图及质谱图  24-25
    3.3.3 β-胡萝卜素的同分异构体分析  25-26
  3.4 液态发酵条件的优化结果  26-34
    3.4.1 碳源对锁掷酵母产β-胡萝卜素的影响  27
    3.4.2 pH 和温度对锁掷母产β-胡萝卜素的影响  27-28
    3.4.3 溶氧和有机氮源对锁掷酵母产β-胡萝卜素的影响  28-30
    3.4.4 响应面法对发酵条件的优化  30-33
    3.4.5 β-胡萝卜素补料分批发酵的研究  33-34
  3.5 锁掷酵母固态发酵条件的研究  34-37
    3.5.1 固态发酵培养基的优化  35-36
    3.5.2 发酵时间的确定  36-37
    3.5.3 培养基含水量和装料量对发酵的影响  37
  3.6 锁掷酵母作为功能性饲料的可行性分析  37-41
    3.6.1 类胡萝卜素的组成  38-39
    3.6.2 氨基酸组成分析  39
    3.6.3 脂肪成分分析  39-41
  3.7 主要结论  41
  3.8 课题展望  41-42
致谢  42-43
参考文献  43-47
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  47

β-胡萝卜素产生菌的选育及其发酵条件的优化

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