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HumanCosavirus套式PCR检测方法的建立及基因组序列分析

作　者: 戴秀强
导　师: 华修国
学　校: 上海交通大学
专　业: 预防兽医学
关键词: HCoSV 套式PCR 序列分析 VP3蛋白原核表达
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Human cosavirus (HCoSV)属微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),为单股正链RNA病毒。至今,共分离出五个病毒种,分别为A,B,C,D,E (Human cosavirus A-E)。虽然HCoSV与临床症状之间的关系尚不明确,但由于检出率相对较高,可能与其他肠道病毒发生混合感染或是疾病发生的诱导因素,对人类健康造成潜在的威胁。因此,建立一种敏感、特异的HCoSV的PCR检测方法具有重要意义。本文从HCoSV套式PCR检测方法的建立及初步应用、病毒基因组序列扩增及分析、VP3蛋白的表达纯化等方面进行了系统研究,结果如下:本研究根据GenBank上发表的HCoSV序列5’端非编码区(5’UTR)设计特异性引物,建立了HCoSV套式PCR检测方法,通过一系列反应条件的优化、特异性实验和敏感性实验,建立了一种快速、简洁、准确的套式PCR方法用于检测HCoSV。PCR反应目的片段为编码5’端非编码区(5’UTR)的RNA片段,大小为414bp。优化50ul反应体系中,退火温度为55℃,引物终浓度为1umol/L,MgCl2的浓度为1.25mmol/L、Taq酶的浓度为0.1 U/ul。与猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪肠道病毒9型(Enterovirus 9,EV9)、星状病毒(Human Astrovirus, HAstV)、博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)、塞弗病毒(Saffold virus, SAFV)等均无特异性反应。利用建立的套式PCR方法对上海地区248份新鲜采集的粪便样品(188份腹泻儿童及60份健康儿童)进行初步检测。结果显示:腹泻儿童中共有6份为阳性,阳性率为3.2%,健康儿童中有1份为阳性,其阳性率为1.6%,进化树及同源性分析发现7份阳性样品中共有5株为HCoSVA种(HCoSV-A),表明HCoSV-A可能为上海地区的流行毒株。实验表明,建立的套式PCR方法可用于临床粪便样品的检测,具有特异、敏感、准确、简洁的特点,该方法的建立为HCoSV感染的临床快速诊断提供了科学依据。根据HCoSV GenBank已知序列信息共设计10对引物,结合RT-PCR和Genome Walking等技术对其中一株病毒的全基因序列进行扩增,并对该株病毒的基因序列进行分析。结果显示:病毒的基因组长度约为7262nt,包括一个多聚蛋白为2125aa。将扩增出的VP3基因片段,克隆到原核表达载体pET-30a上,经酶切、测序鉴定后,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用终浓度l mmol?L-1 IPTG诱导,表达产物以包涵体形式存在。超声波裂解菌体后对包涵体进行溶解,再用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化,并对纯化的蛋白进行复性,全基因组序列的获得与VP3蛋白的表达为下一步蛋白功能基因组研究及ELISA检测方法的建立奠定了基础。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-6
符号说明  6-10
第一章文献综述  10-21
  1 HCoSV 的研究进展  10-11
  2 病原学  11-14
    2.1 形态学特征  11
    2.2 基因组结构  11-13
    2.3 遗传分类  13
    2.4 体外培养  13-14
    2.5 致病性  14
  3 流行病学  14-15
    3.1 分子流行病学  14-15
    3.2 环境中的HCoSV  15
  4 HCoSV 的检测方法  15-20
    4.1 微生物学检测  15-16
      4.1.1 电镜(EM)直接观察法  15-16
      4.1.2 免疫电镜法  16
    4.2 免疫学检测技术  16-17
      4.2.1 免疫吸附凝集试验  16
      4.2.2 酶联免疫试验  16-17
    4.3 分子生物学检测  17-20
      4.3.1 RT-PCR 方法  18-19
      4.3.2 核酸杂交法  19
      4.3.3 荧光定量RT-PCR 法  19-20
      4.3.4 宏基因组学 ( metagenomics)  20
  5 本研究的目的与意义  20-21
第二章 HCoSV 套式PCR 检测方法的建立及应用  21-29
  1 材料  21-22
    1.1 粪便样本  21
    1.2 病毒样品  21
    1.3 主要试剂  21-22
    1.4 主要仪器  22
  2 实验方法  22-23
    2.1 引物的设计与合成  22
    2.2 病毒总RNA 的提取  22-23
    2.3 cDNA 的合成  23
  3 套式PCR 方法的建立  23-24
    3.1 PCR 条件的优化  23
    3.2 PCR 扩增  23-24
    3.3 PCR 产物克隆与DNA 序列分析  24
    3.4 PCR 特异性试验  24
    3.5 PCR 灵敏性试验  24
    3.6 套式PCR检测方法的应用  24
  4 结果  24-27
    4.1 最佳的PCR 反应条件  24-25
    4.2 PCR 法的特异性  25-26
    4.3 PCR 法的灵敏性  26
    4.4 临床样品的检测  26-27
  5 讨论  27-29
第三章 HCoSV 基因组的扩增及序列分析  29-47
  1 技术原理  29-30
  2 引物设计  30-32
  3 反应条件  32-35
    3.1 染色体步移技术  32-33
      3.1.1 1~（st） PCR 反应  32
      3.1.2 2~(nd) PCR 反应  32-33
      3.1.3 3~(nd) PCR 反应  33
    3.2 普通PCR 反应条件  33-34
    3.3 长片段扩增反应条件  34-35
  4 结果  35-45
    4.1 HCoSV 本实验毒株基因结构图  35-36
    4.2 HCoSV 本实验毒株基因组序列信息  36-39
    4.3 系统分析及进化树  39-45
  5 讨论  45-47
第四章 HCoSV VP3 蛋白的原核表达及纯化  47-59
  1 材料  47-48
    1.1 粪便样品、菌株和质粒  47
    1.2 主要试剂  47
    1.3 主要仪器  47-48
  2 实验方法  48-55
    2.1 引物的设计与合成  48
    2.2 RT-PCR 反应  48-49
      2.2.1 cDNA 的合成  48
      2.2.2 PCR 扩增  48-49
    2.3 目的片段的纯化回收  49-50
    2.4 目的基因的克隆  50-51
      2.4.1 克隆质粒的构建  50
      2.4.2 克隆质粒的筛选及制备  50-51
        2.4.2.1 克隆质粒的转化及筛选  50
        2.4.2.2 克隆质粒的提取及鉴定  50-51
    2.5 原核表达载体PET-30a-VP3 的构建  51-53
      2.5.1 双酶切反应  51-52
      2.5.2 PET-30a 空载体的线性化双酶切  52-53
      2.5.3 目的基因与线性化表达载体pET-30a 的连接  53
      2.5.4 原核表达载体的转化与鉴定  53
    2.6 重组表达载体的诱导表达  53
    2.7 最优表达时间的确定  53-54
    2.8 表达产物的纯化  54
      2.8.1 包涵体的分离和变性  54
      2.8.2 目的蛋白的纯化  54
    2.9 表达产物的复性  54-55
  3 结果  55-57
    3.1 VP3 基因的PCR 结果  55
    3.2 目的基因的克隆鉴定  55
    3.3 重组表达载体的鉴定  55-56
    3.4 蛋白原核表达及最优表达时间的确定  56
    3.5 蛋白的可溶性分析  56-57
    3.6 蛋白的纯化与复性  57
  4 讨论  57-59
第五章结论  59-61
参考文献  61-68
附录Ⅰ 试剂配置  68-71
攻读学位期间发表的学术论文目录  71-72
致谢  72-74

HumanCosavirus套式PCR检测方法的建立及基因组序列分析

内容摘要

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