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猪α-干扰素的原核表达及其活性测定

作　者: 贾自文
导　师: 章金刚；焦新安
学　校: 扬州大学
专　业: 遗传学
关键词: 猪α-干扰素稀有密码子基因克隆原核表达抗病毒活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

近些年来,猪的病毒性疾病时常危害着养猪业的正常发展,研究表明猪α-干扰素具有显著的抗病毒功能,对猪的很多种病毒性传染病,如流行性腹泻、猪瘟、蓝耳病、传染性胃肠炎等都有一定防治效果。目前,利用基因工程手段研制和开发重组干扰素制剂已成为研究热点,并已有多种类型干扰素产品成功上市,但仍远远满足不了市场需求。本文对猪IFN-α密码子序列进行了优化改造,并采用原核表达系统对猪IFN-α成功进行了表达,纯化及抗病毒活性研究,为重组猪IFN-α的生产和应用打下了基础。一、猪α-干扰素基因序列的改造与克隆本研究在前期获得猪IFN-α基因序列的基础上,根据大肠杆菌的偏嗜性,对其密码子序列进行改造。改造后的猪IFN-α-基因序列与原序列相比,碱基改变79个,占全基因序列的16%;密码子改变63个,占总密码子数的38%;基于原序列中含有5个编码半胱氨酸的密码子,为防止蛋白折叠中二硫键的错配,将第86位半胱氨酸密码子(UGC)改造为酪氨酸密码子(UAC),使得Cys1-Cys99,Cys29-Cys139之间形成两个分子内二硫键。改造后序列以引物的形式分段合成,采用重叠延伸PCR(SOE PCR)进行依次扩增,并最终获得改造后的猪IFN-α全基因序列;将改造后的猪IFN-α基因克隆到pMT-Easy载体中,酶切及测序鉴定结果表明成功构建克隆载体pMT-poIFN-α。二、重组猪α-干扰素的原核表达、鉴定与纯化重新设计引物,并引入NdeI、EcoRI酶切位点,构建重组猪α-干扰素的原核表达载体pET28-poIFN-α,酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,添加IPTG诱导表达;经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约21kDa的位置出现明显的新生蛋白条带,与目的蛋白分子量大小相近,采用Western Blot对其进一步进行鉴定后,表明重组猪α-干扰素成功获得了表达。目的蛋白为N端带有(His)6标签的融合蛋白,主要以包涵体形式存。对表达条件(诱导时间、温度及IPTG浓度)进行优化后,目的蛋白占到菌体总蛋白的39.8%,实现了重组猪α-干扰素在大肠杆菌中的高效表达。表达产物经镍琼脂糖亲和层析方法进行纯化后,目的蛋白纯度达到90%以上,获得了较高纯度的重组猪α-干扰素。三、重组猪α-干扰素抗病毒活性研究纯化后的重组猪α-干扰素经流加稀释法复性后,采用MDBK/VSV与PK15/VSV系统分别鉴定了重组猪α-干扰素的抗病毒活性,并采用微量细胞病变抑制法,通过MDBK/VSV系统测定了重组猪α-干扰素的抗病毒活性效价约为2.19×106 U/mg,获得了具有较高活性的重组猪α-干扰素,为重组猪IFN-α的生产和应用打下了基础。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章综述  11-19
  1 干扰素的概况  11-15
  2 猪Α-干扰素的研究进展  15-16
  参考文献  16-19
第二章猪Α-干扰素基因的克隆与序列分析  19-28
  1 实验材料  19
    1.1 质粒与菌株  19
    1.2 工具酶和试剂盒  19
    1.3 试剂与培养基  19
  2 实验方法  19-24
    2.1 引物的设计  19-21
    2.2 重叠引物PCR 法扩增猪α-干扰素全基因  21-22
    2.3 目的基因的克隆  22-24
    2.4 目的基因的序列分析  24
  3 实验结果  24-26
    3.1 SOE PCR 扩增结果  24-25
    3.2 酶切鉴定及测序结果  25
    3.3 目的基因的序列分析  25-26
  4 讨论  26-27
  参考文献  27-28
第三章猪Α-干扰素在大肠杆菌中的表达  28-45
  1 实验材料  28-30
    1.1 质粒与菌株  28
    1.2 工具酶与试剂盒  28
    1.3 试剂与培养基  28-30
  2 实验方法  30-36
    2.1 引物的设计与目的基因的扩增  30-31
    2.2 原核表达载体pET28-poIFN-α的构建  31-32
    2.3 表达载体pET28-poIFN-α的双酶切鉴定  32
    2.4 工程菌的诱导表达  32
    2.5 表达产物的SDS-PAGE 分析  32-33
    2.6 表达产物的定位  33
    2.7 表达产物的Western Blot 鉴定  33-34
    2.8 表达条件的优化  34-35
    2.9 包涵体的制备与粗纯  35
    2.10 重组猪α-干扰素的亲和层析纯化  35
    2.11 重组猪α-干扰素的复性  35-36
    2.12 蛋白浓度的测定（BCA 法）  36
  3 实验结果  36-41
    3.1 目的基因的扩增  36-37
    3.2 pET28-poIFN-α的双酶切鉴定  37
    3.3 表达产物的SDS-PAGE 分析  37-38
    3.4 表达产物的定位  38
    3.5 表达产物的Western Blot 鉴定  38
    3.6 表达条件的优化  38-40
    3.7 重组猪α-干扰素的亲和层析纯化  40-41
    3.8 蛋白浓度的测定  41
  4 讨论  41-43
  参考文献  43-45
第四章重组猪Α-干扰素的抗病毒活性研究  45-50
  1 实验材料  45
    1.1 细胞、毒株  45
    1.2 试剂与培养基  45
  2 实验方法  45-46
    2.1 MDBK 和PK15 的培养与鸡胚的孵育  45
    2.2 VSV 在鸡胚中的扩增  45-46
    2.3 K(a|¨)rber 法测定VSV 的TCID_(50)  46
    2.4 微量细胞病变抑制法测定重组猪α-干扰素的活性  46
  3 实验结果  46-48
    3.1 K(a|¨)rber 法测定VSV 的TCID_(50)  46-47
    3.2 重组猪α-干扰素的活性测定  47-48
  4 讨论  48-49
  参考文献  49-50
总结与展望  50-51
附录  51-56
致谢  56-57
攻读学位期间发表的论文  57

猪α-干扰素的原核表达及其活性测定

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