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六个miniSTR基因座群体遗传学研究

作　者: 李霞
导　师: 丛斌
学　校: 河北医科大学
专　业: 法医学
关键词: 分子克隆技术等位基因分型标准物 miniSTR DNA分型
分类号: Q3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:短串联重复序列(short tandem repeats, STR)遗传标记系统,由于在人类基因组中分布广泛,具有高度的遗传多态性以及简单快捷的检测方法,已成为法医物证鉴定的主流技术。然而,在法医学实践中经常会面临高度降解的检材,如使用商品化STR试剂盒进行扩增,片段较大的STR基因座往往无法得到正确的分型或是分型失败。miniSTR基因座分析技术即是在设计引物时,使其尽可能靠近核心重复序列从而缩短扩增片段长度,以提高检测的灵敏度及降解片段的检出率。miniSTR基因座已被欧洲DNA分型工作组(the european DNA profiling group, EDNAP)定义为继STR之后的新一代遗传标记,2006年美国AB公司已经研制开发了MiniFiler试剂盒。miniSTR,miniX-STR,miniY-STR的研究已显示了其在法医学领域的重要价值。miniSTR应用于法医学时,进行准确、快速、方便的分型检测显得至关重要,因此对其分型结果的准确性、公正性和可靠性提出了更高的要求。而等位基因分型标准物(allelic ladder,简称AL)的制备又是实现基因座准确分型命名的关键。只有具备了一套精确的、国际标准化命名的分型标准物,才有可能对miniSTR分型结果做出正确判型和命名,才有可能在各国、各实验室之间实现miniSTR分型的可比性。为研究更多的miniSTR基因座用于法医学鉴定,解决一些疑难检材的DNA分型,本课题拟采用分子克隆技术制备六个miniSTR基因座D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S1122、D10S1435和D17S1301等位基因分型标准物,解决miniSTR分型的准确性和标准化问题,并应用于湖南汉族群体遗传学研究中,探讨该方法制备的等位基因分型标准物在法庭科学实践中的应用价值。方法:采用Chelex-100法提取155份湖南汉族无关健康个体全血基因组DNA。采用PCR扩增,10%变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,银染显色,在所选样本中筛选、分离六个miniSTR基因座所有目的等位基因,用Promega公司凝胶回收试剂盒纯化后,将其分别插入到pGEM-T载体中,转染DH5αTM感受态大肠杆菌,扩大培养,4%琼脂糖凝胶电泳初步筛选阳性克隆,测序证实连接正确目的等位基因的核心序列结构和重复次数,并按照国际法庭血液遗传学学会(international society of forensic haemogenetics, ISFH )推荐的命名原则对各等位基因命名;提取重组质粒,以其为模板进行PCR扩增,根据琼脂糖检测的显色强度或GeneQuant微量蛋白核酸检测仪对扩增产物的定量结果,调整各成分的比例,使峰高尽可能达到平衡,混合各等位基因PCR扩增产物,即获得各miniSTR基因座的等位基因分型标准物。应用自制miniSTR基因座等位基因分型标准物进行所选样本的群体遗传学研究:将基因座D10S1248和D17S1301上游引物5’端用6-FAM荧光标记,基因座D2S441和D9S1122上游引物5’端用HEX荧光标记,基因座D1S1677和D10S1435上游引物5’端用TAMRA荧光标记,进行PCR扩增,扩增产物与自制等位基因标准分型标准物在ABI PRISM 310基因分析仪上同步电泳,结果用Genemapper 3.2分析扩增产物片段相对大小并进行样本基因分型。利用统计软件计算各基因座法医学参数。结果:本研究建立了分子克隆技术制备miniSTR基因座等位基因分型标准物的方法。155名湖南汉族无关个体中D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S1122、D10S1435和D17S1301六个miniSTR基因座分别筛选出9、7、7、6、7和8个等位基因,经测序证实了每个基因座等位基因核心重复序列的结构和大小,分别为[GGAA]、[TCTA]、[GGAA]、[TAGA]、[TATC]和[AGAT],并构建了优质的等位基因分型标准物。利用自制的等位基因分型标准物进行所选样本的群体遗传学研究发现:D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S1122、D10S1435和D17S1301基因座分别检出9、7、7、6、7和8个等位基因和21、18、15、15、22和20种基因型,基因型频率分布经χ2检验,均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。六个基因座在中国汉族人群的杂合度观察值(Ho)分别为0.729、0.735、0.665、0.787、0.677和0.671;多态性信息含量(PIC)分别依次为0.699、0.716、0.591、0.698、0.752和0.663;非父排除率(PE)分别依次为0.475、0.735、0.376、0.575、0.384和0.385;个人识别率(DP)分别依次为0.888、0.889、0.814、0.875、0.921和0.869。六个miniSTR基因座的累积非父排除概率为0.98,累积个人识别率为0.999997。结论:本研究应用分子克隆技术制备了六个miniSTR基因座D10S1248、D2S441、D1S1677、D9S1122、D10S1435和D17S1301的等位基因分型标准物,分别包括了9、7、7、6、7和8个等位基因,构成了miniSTR分型试剂盒的重要组成成分。将上述等位基因分型标准物应用于湖南汉族人群的群体遗传学研究,发现该六个miniSTR基因座具有中高度遗传多态性,可用于法医学个人识别和亲权鉴定,并在高度降解检材的检测中具有较高的应用价值。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
研究论文六个miniSTR 基因座群体遗传学研究  13-68
  前言  13-14
  材料与方法  14-24
  结果  24-28
  附图  28-37
  附表  37-43
  讨论  43-57
  结论  57-58
  参考文献  58-63
  附录  63-68
综述 MiniSTR 基因座的研究进展及其法医学应用  68-89
   参考文献  81-89
致谢  89-90
个人简历  90-91

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