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斑马鱼胚胎细胞中Cre/lox介导的定点整合

作　者: 秦瑶
导　师: 朱作言；汪亚平
学　校: 中国科学院研究生院（水生生物研究所）
专　业: 遗传学
关键词: Cre/lox系统 重组酶介导的盒式交换 定点整合 斑马鱼
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


外源基因的随机整合阻碍了传统转基因方法在鱼类定向育种领域的应用。利用基因打靶技术有望实现外源基因的定点整合:控制外源基因的整合位点,整合率和时空表达。Cre/lox位点特异性重组系统介导的盒式交换反应是一种高效简单的基因定点整合新方法。本研究证实了该方法在鱼类中的可行性,并以斑马鱼为模型,初步建立了基于Cre/lox系统的鱼类定点整合技术。本文共五章:第一章:综述传统转基因方法的局限性,鱼类基因打靶技术的发展,Cre/lox系统在转基因中的应用和在斑马鱼中应用的研究现状。第二章:盒式交换反应载体的构建。构建了两种flox重组质粒:靶位载体pCMVlox66CreintEGFPlox2272和打靶载体plox71RFPlox2272。第三章:共注射Cre RNA和两种flox重组质粒入斑马鱼受精卵,红色荧光的出现和PCR检测及测序结果表明打靶载体上的RFP报告基因高效置换了靶位载体上lox位点间的DNA片断。证实了Cre/lox系统介导的盒式交换反应在斑马鱼体内的可行性。第四章:采用传统转基因方法建立转pCMVlox66CreintEGFPlox2272的斑马鱼品系,该品系含高效表达外源基因的靶位并自身表达一定的Cre酶。将打靶载体plox71RFPlox2272注射入F2代受精卵中,成功筛选到三尾显示红色荧光的斑马鱼。PCR和测序进一步证实了盒式交换反应的发生。由此,初步建立了基于Cre/lox系统的鱼类定点整合技术。

全文目录


中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
略语表  9-10
第一章 研究背景与研究目标  10-25
  1. 传统鱼类基因转移技术  10-11
    1.1 转基因鱼研究历史  10
    1.2 传统转基因方法  10-11
    1.3 外源基因随机整合产生的问题  11
  2. 基因打靶技术  11-13
    2.1 基因打靶概述  11-12
    2.2 鱼类中的基因打靶  12-13
  3.C re/lox 位点特异性重组系统  13-24
    3.1 位点特异性重组  13
    3.2 Cre/lox系统概述  13-16
    3.3 Cre/lox系统在转基因中的应用  16-19
    3.4 提高Cre/lox系统整合反应效率的两种策略  19-21
    3.5 Cre重组酶介导的盒式交换反应  21-23
    3.6 Cre酶毒性问题  23
    3.7 Cre/lox系统在斑马鱼中的应用  23-24
  4. 研究目标  24-25
    4.1 研究目标  24
    4.2 技术路线  24-25
第二章 盒式交换系统载体的构建  25-40
  1. 材料和方法  25-34
    1.1 构建双交换载体的元件  25
    1.2 Cre基因的修饰  25-27
    1.3 载体元件DNA片段的制备  27-30
    1.4 DNA重组、转化及重组质粒鉴定  30-34
  2. 结果  34-37
    2.1 重组质粒的构建流程  34-37
    2.2 重组质粒的酶切鉴定  37
  3. 讨论  37-40
第三章 斑马鱼胚胎中游离DNA片段的盒式交换反应  40-51
  1. 材料与方法  40-44
    1.1 实验鱼  40
    1.2 CreRNA的制备  40-42
    1.3 CreRNA作用浓度的选择  42
    1.4 游离DNA片段盒式交换反应  42-44
  2. 结果  44-49
    2.1 体外转录模板pCSCre的鉴定  44-45
    2.2 Cre 安全浓度的确定  45
    2.3 斑马鱼胚胎中游离DNA 片段的盒式交换反应  45-49
  3 讨论  49-51
第四章 斑马鱼胚胎中基因组片段的盒式交换反应  51-68
  1. 材料与方法  51-57
    1.1 转pCMVlox66CreintEGFPlox2272斑马鱼研制  51-52
    1.2 内含子剪切的检测  52-56
    1.3 外源基因整合的PCR检测  56
    1.4 基因打靶操作  56-57
  2. 结果  57-65
    2.1 转pCMVlox66CreintEGFPlox2272斑马鱼品系的建立  57-58
    2.2 检测内含子的剪切  58-60
    2.3 外源基因整合分析  60-61
    2.4 内源Cre介导的盒式交换反应  61-65
  3. 讨论  65-68
小结  68-70
参考文献  70-75
附录  75-77
致谢  77

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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