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C57BL/6J小鼠精子冷冻与单精子胞浆内注射技术研究

作　者: 贾青
导　师: 芮荣；徐平
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: C57BL/6J小鼠 精子冷冻 单精子胞浆内注射 体外培养
分类号: S865.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


随着生命科学研究的日益发展,实验动物科学也在我国得到快速的发展,小鼠是应用最为广泛的实验动物之一。C57BL/6J品系小鼠作为应用最广泛的一种近交系小鼠,因其遗传背景稳定,是研究基因突变的重要工具;多种转基因小鼠均以C57BL/6J品系小鼠为遗传背景。如何开展这些基因工程小鼠的保种工作,建立一套有效的小鼠种质资源保存方案显得尤为重要。胚胎生物技术和低温生物学技术的联合应用在小鼠保种中已获得成功,冷冻精子和胚胎业已成为建立冷冻库、保存特定品系最有效的策略。精子冷冻的技术操作方便、快速、无需特殊的设备,应用前景十分广阔。小鼠精子冷冻已成为小鼠种质资源保存的有效方法之一,其冷冻精子体外受精技术对于部分品系的小鼠来说已很成熟,但对于一些特殊品系如应用最广的C57BL/6J近交系小鼠及以C57BL/6J为遗传背景的转基因小鼠,冷冻精子体外受精卵裂率仍然很低。本实验以C57BL/6J小鼠为研究对象,旨在通过对该品系小鼠精子冷冻及冷冻精子的体外受精、单精子胞浆内注射技术的研究,全面提高该品系小鼠体外受精卵裂率,为C57BL/6J小鼠的资源保存奠定基础。1 C57BL/6J小鼠精子冷冻技术研究本试验主要以C57BL/6J品系小鼠为研究对象,系统比较冷冻稀释液、解冻方法、获能时间和获能液、体外受精液、胚胎体外培养液等对该品系小鼠冷冻精子体外受精卵裂率与胚胎发育率的影响。结果表明:（1）以R18S3为基础液添加15%或20%卵黄离心上清液作为冷冻稀释液,可有效提高C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精卵裂率（分别为36%和40%）,但添加不同浓度的甘油或乙酰胺却会降低冻精体外受精卵裂率,混合添加卵黄和甘油冷冻效果不如单独添加卵黄,但比单独使用甘油效果要好;（2）采用37℃水浴15min和先60℃水浴6s再37℃水浴解冻15min 2种方法解冻精子,C57BL/6J小鼠冻精体外受精卵裂率无显著差异（P＞0.05）,因一步解冻法操作简便,可作为常规解冻程序;（3）分别采用30、50和60min为C57BL/6J小鼠冻精的获能时间,体外受精卵裂率分别为17.3%、25%和19.4%,以50min获能效果最佳;（4）在100μl HTF体外受精液中分别添加1.0 IU/ml FSH和0.1ug/ml E2,冷冻精子体外受精卵裂率分别为24.1%和27.3%,与不添加对照组（25%）相比没有明显提高（P＞0.05）;（5）在100μl HTF中分别添加45μmol/L肾上腺素、75μmol/L亚牛磺酸、5 IU/ml肝素、7.5 mmol/L牛磺酸,以及不含BSA的TYH中添加0.75 mmol/L MBCD作为精子获能液,结果只有添加5 IU/ml肝素可提高冷冻精子体外受精卵裂率,但无统计学差异（P＞0.05）;用R18S3+15%卵黄上清液冷冻精子时,添加5 IU/ml肝素的体外受精卵裂率最高（49.3%）;若用R18S3+20%卵黄离心上清液冷冻,添加45μmol/L肾上腺素组所获体外受精卵裂率和囊胚发育率最高;（6）体外培养实验表明,KSOM更适合桑椹胚前的发育,而CZB更适合桑椹胚向囊胚的发育;（7）采用R18S3+20%卵黄离心上清冷冻C57BL/6J小鼠精子,并配合使用100μL HTF+45μmol/L肾上腺素作为精子获能液,体外受精所获2-细胞胚胎20枚移植至1只受体小鼠,产仔4只,产仔率为20%。2 C57BL/6J小鼠ICSI技术的研究以C57BL/6J品系小鼠及DBA♂×C57BL/6J♀（B6D2FI）杂交鼠为研究对象,以Piezo操作系统为技术支撑;通过小鼠卵母细胞胞浆内精子注射（ICSI）技术,系统比较不同注射针内径、不同显微操作液、不同采卵时间对ICSI结果的影响,并比较鲜精、冻精体外受精和ICSI显微受精结果。结果表明:（1）使用内径为4～6μm的注射针,C57BL/6J小鼠ICSI胚胎卵裂率为88.5%,显著高于8～10μm内径组（85.7%对53.8%,P＜0.05）;（2）C57BL/6J小鼠注射hCG后19h采卵进行ICSI操作,卵子存活率虽比注射后12或14h采卵组降低,但其卵裂率最高（92.7%）,囊胚发育率也最高（36%）;（3）C57BL/6J和B6D2F1小鼠卵使用Hepes-CZB显微操作液,ICSI操作后的卵子存活率分别为36.1%和61.2%,卵裂率为82.4%和63.1%,囊胚发育率为50%和45.8%;当操作液中添加3%蔗糖时,卵存活率分别为59.6%和80.2%,卵裂率为90.3%和82.1%,两品系小鼠存活率和卵裂率较对照组都有显著提高（P＜0.05）;囊胚发育率为35.7%和26.3%,有显著降低（P＜0.05）;当操作液中添加0.5mg/L细胞松弛素B,ICSI操作后的卵子存活率为49.1%和73.0%,卵裂率为90.0%和82.0%,两品系小鼠存活率、卵裂率都得到显著提高（P＜0.05）;囊胚发育率为37.0%和33.0%,显著下降（P＜0.05）;（4）C57BL/6J小鼠鲜精常规体外受精的卵裂率为90.4%,与其冻精体外受精后的卵裂率（25.0%、36.0%、40.0%）相比差异显著（P＜0.05）,与冻精单精注射后的卵裂率（53.8%）也差异显著（P＜0.05）;但冻精ICSI卵裂率与冻精常规体外受精后的卵裂率相比,明显提高（P＜0.05）。冷冻精子ICSI后囊胚发育率显著低于新鲜精子常规体外受精后体外培养的囊胚率（56.3%对71.6%,P＜0.05）;（5）用添加3%蔗糖的Hepes-CZB作为显微操作液,经R18S3冷冻稀释液冷冻保存的C57BL/6J小鼠精子解冻后进行ICSI注射,所获40枚2-细胞胚胎移植给ICR受体假孕小鼠,获得着床8d胚胎13枚,妊娠率为32.5%。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-14
简写及缩略语  14-15
前言  15-17
第一部分 文献综述  17-46
  第一章 实验小鼠精液冷冻保存的研究进展  17-32
    1 精子冷冻保存研究简史  17-18
    2 C57BL/6J小鼠精子冷冻保存现状  18
    3 精子冷冻保存原理  18-19
    4 精子的冷冻损伤  19
    5 小鼠精子冷冻保存方法  19-23
      5.1 冷冻保护剂的研究与应用  19-21
      5.2 常用的小鼠精子冷冻稀释液  21-22
      5.3 小鼠精子冷冻保存的基本程序  22
      5.4 冷冻保存小鼠精子的包装方法  22
      5.5 小鼠冷冻精子的解冻  22-23
      5.6 精液解后的处理  23
    6 冷冻精液质量评定  23-24
      6.1 常规分析  23-24
      6.2 精子尾部低渗膨胀试验  24
      6.3 体外受精  24
    7 影响精液冷冻保存效果的因素  24-26
      7.1 低温保护剂(CPM)的影响  24-25
      7.2 渗透压的影响  25
      7.3 冷冻和解冻温度的影响  25-26
      7.4 小鼠的个体差异  26
      7.5 其它因素  26
    8 C57BL/6J品系小鼠及以其为遗传背景转基因小鼠精子冷冻  26-27
    参考文献  27-32
  第二章 小鼠单精注射的研究进展  32-46
    1 小鼠ICSI的研究简史  32-33
    2 显微操作系统  33
    3 影响胞质内单精注射的因素  33-40
      3.1 技术因素  33-37
      3.2 非技术因素  37-40
    4 小鼠ICSI的应用前景  40-41
    参考文献  41-46
第二部分 实验研究  46-89
  第三章 C57BL/6J小鼠精子冷冻技术的研究  46-74
    1 材料  47-51
      1.1 实验动物  47
      1.2 主要仪器设备  47-48
      1.3 主要试剂药品  48
      1.4 试剂配制  48-51
    2 方法  51-54
      2.1 嘴吸式移卵针的拉制  51
      2.2 雌鼠的超数排卵  51
      2.3 精子冷冻  51
      2.4 培养液的预平衡  51-52
      2.5 冻精的解冻与体外受精  52
      2.6 胚胎培养和移植  52-53
      2.7 实验设计  53-54
      2.8 数据处理  54
    3 结果  54-63
      3.1 C57BL/6J和Y3F小鼠冻精经不同方法解冻后的体外受精卵裂率  54-55
      3.2 获能时间对小鼠冻精体外受精卵裂率的影响  55
      3.3 冻精获能液中添加不同生物活性物质对体外受精卵裂率的影响  55-58
      3.4 不同受精液对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精卵裂率的影响  58
      3.5 卵黄对C57BL/6J小鼠冻精体外受精卵裂率的影响  58-59
      3.6 甘油浓度对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精卵裂率的影响  59-60
      3.7 甘油—卵黄配伍对C57BL/6J小鼠冻精体外受精卵裂率的影响  60-61
      3.8 乙酰胺对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精卵裂率的影响  61
      3.9 混合添加乙酰胺和卵黄对C57BL/6J小鼠冻精体外受精卵裂率的影响  61-62
      3.10 C57BL/6J小鼠体外受精胚胎的培养与移植  62-63
    4 讨论  63-69
      4.1 解冻方法对C57BL/6J小鼠冻精体外受精结果的影响  63
      4.2 获能时间对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精的影响  63-64
      4.3 获能液中添加生物活性物质对体外受精的影响  64-65
      4.4 受精液中添加FSH和E2对C57BL/6J小鼠冻精体外受精结果的影响  65-66
      4.5 不同浓度卵黄对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精结果的影响  66
      4.6 不同浓度甘油对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精结果的影响  66-67
      4.7 甘油—卵黄联合使用对C57BL/6J小鼠冻精体外受精结果的影响  67
      4.8 乙酰胺对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精结果的影响  67
      4.9 小鼠体外受精胚胎的培养  67-69
    参考文献  69-74
  第四章 C57BL/6J小鼠ICSI技术的研究  74-89
    1 材料与方法  75-80
      1.1 实验动物  75
      1.2 主要仪器设备及耗材  75
      1.3 试剂配制  75-76
      1.4 显微操作针的拉制  76
      1.5 ICSI操作准备  76-78
      1.6 显微注射  78
      1.7 注射卵的体外培养和胚胎移植  78
      1.8 实验设计  78-79
      1.9 统计分析  79-80
    2 结果  80-83
      2.1 采卵时间对ICSI结果的影响  80
      2.2 不同注射针直径对ICSI结果的影响  80-81
      2.3 高渗显微操作液对小鼠ICSI胚胎发育率的影响  81
      2.4 添加细胞松驰素(CB)对小鼠ICSI胚胎发育率的影响  81-82
      2.5 C57BL/6J小鼠新鲜精子、冷冻精子体外受精及冻精ICSI结果的比较  82
      2.6 胚胎移植  82-83
    3 讨论  83-87
    参考文献  87-89
全文结论  89-91
图版  91-95
附录 溶液配制  95-96
致谢  96

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 狩猎、野生动物驯养 > 各种野生动物驯养 > 实验用动物 > 小白鼠
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