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牦牛胎盘滋养层细胞的分离培养与鉴定

作　者: 赵志文
导　师: 余四九
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 牦牛滋养层细胞分离纯化体外培养
分类号: S823.85
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 24次
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内容摘要

为了建立一种稳定、简便及较高纯度的牦牛胎盘滋养层细胞的获得方法,本研究采用联合消化液对妊娠8～10周龄的胎儿胎盘组织进行消化,获得了单细胞悬液;通过反复贴壁法和消化排除法对滋养层细胞进行了纯化,探索其最适培养基、最适FBS浓度及最适PH;并观察了其大体形态、胞核的特点、细胞角蛋白7(cytokeratin CK7)和波形蛋白(vimentin Vim)表达等。研究获得如下结果。(1)采集的胎盘组织样品需在4℃的温度条件下,Hank’s液保存液保存,24h内进行处理;在37℃下,采用胰蛋白酶和胶原酶1:1联合消化法分离滋养层细胞的分离效果好;通过400目筛网,percoll密度分离液分离,可基本将滋养层细胞和其他杂质细胞分离。(2)牦牛胎盘绒毛膜滋养层细胞在pH6.8～7.0、20%FBS的DMEM/F12培养基条件下适宜原代培养,而在pH6.8～7.0、10%FBS的DMEM/F12培养基条件下适宜传代培养。(3)传代5次后透视显微镜观察发现,细胞为上皮样形态,呈片状铺展生长;细胞角蛋白染色阳性,波形蛋白染色阴性;阳性细胞率达90%,台盼蓝排斥试验显示活细胞率超过95%。研究表明,用消化排除法纯化,调整培养基pH6.8～7.0添加10%FBS的DMEM/F12培养基条件下传代培养,可简单、有效地获得较高纯度牦牛胎盘滋养层细胞。

全文目录

摘要  4-5
Summary  5-9
第一篇文献综述哺乳动物细胞培养  9-29
  1 体外培养细胞的特征  9-13
    1.1 形态学特征  9-10
      1.1.1 贴附型  9-10
      1.1.2 悬浮型  10
    1.2 遗传学特征  10-11
      1.2.1 核型变化  11
      1.2.2 永生化和恶变  11
    1.3 生长特征  11-13
      1.3.1 贴附并伸展  12-13
      1.3.2 接触抑制  13
      1.3.3 密度抑制  13
  2 体外培养动物细胞的生长与增殖  13-21
    2.1 单个细胞的生长过程  13-14
      2.1.1 G1期  13-14
      2.1.2 S 期  14
      2.1.3 G2期  14
      2.1.4 M 期  14
    2.2 细胞系的生长过程  14-19
      2.2.1 原代培养  15-18
      2.2.2 传代培养期  18
      2.2.3 衰退期  18-19
    2.3 每代细胞的生长过程  19-21
      2.3.1 潜伏期  19-20
      2.3.2 指数生长期  20
      2.3.3 停滞期  20-21
      2.3.4 衰亡期  21
  3 体内外细胞分化特点  21-25
    3.1 体内外细胞分化的差异  21-22
    3.2 培养细胞分化状态的变化  22-23
    3.3 培养细胞的分化  23-25
      3.3.1 不适应  23-24
      3.3.2 脱分化或去分化  24-25
  4. 影响动物细胞体外生长的因素  25-29
    4.1 培养基的pH 对细胞生长的影响  25
    4.2 温度条件对细胞生长的影响  25-29
      4.2.1 生理温度范围  25-26
      4.2.2 高温的影晌  26-27
      4.2.3 低温的影响  27
      4.2.4 渗透压  27-28
      4.2.5 气相环境  28-29
第二篇实验部分牦牛胎盘绒毛膜滋养层细胞的分离培养  29-48
  前言  29
  1 实验材料与方法  29-36
    1.1 实验材料  29-31
      1.1.1 实验动物  29-30
      1.1.2 药品和试剂  30
      1.1.3 实验仪器与设备  30-31
    1.2 实验方法  31-36
      1.2.1 胎盘绒毛膜滋养层组织样品的采集与保存  31-32
        1.2.1.1 组织样品的采集  31
        1.2.1.2 组织样品的保存温度与时间  31-32
      1.2.2 胎盘绒毛膜滋养层细胞的原代分离培养  32-33
        1.2.2.1 手术分离  32
        1.2.2.2 消化法分离  32
        1.2.2.3 组织块培养法分离培养  32-33
        1.2.2.4 细胞活率测定  33
      1.2.3 绒毛膜滋养层细胞的纯化和传代培养  33-35
        1.2.3.1 纯化和传代培养  33-34
          1.2.3.1.1 反复贴壁法  33
          1.2.3.1.2 消化排除法  33-34
        1.2.3.2 影响纯化和传代培养的因素  34-35
          1.2.3.2.1 最适培养基筛选试验  34
          1.2.3.2.2 最适FBS 浓度试验  34
          1.2.3.2.3 滋养层细胞最适酸碱度试验  34-35
          1.2.3.2.4 细胞冻存与复苏试验  35
      1.2.4 绒毛膜滋养层细胞的鉴定  35-36
        1.2.4.1 HE 染色法鉴定  35
        1.2.4.2 免疫组织化学鉴定  35-36
  2 结果  36-42
    2.1 组织样品的保存与时间  36-38
    2.2 胎盘绒毛膜滋养层细胞的原代分离培养  38
      2.2.1 消化法分离培养  38
      2.2.2 组织块法分离培养  38
    2.3 绒毛膜滋养层细胞的纯化和传代培养  38-39
    2.4 影响纯化和传代培养的因素  39-41
      2.4.1 消化液  39
      2.4.2 培养基  39
      2.4.3 FBS 的添加浓度  39-40
      2.4.4 培养基的酸碱度  40-41
      2.4.5 传代细胞的冻存和复苏  41
    2.5 绒毛膜滋养层细胞的鉴定  41-42
      2.5.1 HE 染色法鉴定  41-42
      2.5.2 免疫组织化学鉴定  42
  3 讨论  42-47
    3.1 组织样品的保存温度与时间实验  42
    3.2 胎盘绒毛膜滋养层细胞的原代分离培养  42-44
      3.2.1 消化法分离培养  43
      3.2.2 组织块法分离培养  43-44
    3.3 影响纯化和传代培养的因素  44-46
      3.3.1 培养基  44
      3.3.2 酸碱度  44-45
      3.3.3 血清  45-46
    3.4 细胞传代与纯化  46
    3.5 细胞标志  46-47
  4 结论  47-48
附图  48-50
附图说明  50-52
参考文献  52-57
常用溶液配方  57-59
致谢  59-60
导师简介  60-61
个人简介  61-63

牦牛胎盘滋养层细胞的分离培养与鉴定

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