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驯鹿β-防御素-1（reBD-1）基因的原核表达及蛋白活性的鉴定

作　者: 苏丽娜
导　师: 杨银凤
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 驯鹿防御素基因克隆蛋白表达抗菌活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

防御素(defensin)是生物体先天性免疫系统中的一类短肽,是内源性抗菌肽中的一个大家族。防御素具有广谱的抗菌活性,无论在细胞内或细胞外都可以直接杀死细菌、真菌、病毒等病原微生物,维持机体内环境的稳定,同时对某些恶性肿瘤细胞也有毒杀作用。β-防御素是防御素家族的重要成员之一,本文对驯鹿β-防御素的表达、分离纯化及抗菌活性等方面展开了初步研究。本试验旨在构建驯鹿β防御素-1(reindeerβ-defensin -1,reBD-1)基因的原核表达载体pET-32a(+)/reBD-1,诱导reBD-1融合蛋白在大肠杆菌中表达,并对其表达产物的生物学活性进行评价。利用RT-PCR技术扩增出编码reBD-1前原肽基因。从重组克隆载体pMD-19T/reBD-1中扩增reBD-1成熟肽编码序列,并克隆入pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达reBD-1融合蛋白。表达的融合蛋白扩大培养,进一步纯化后进行体外抑菌实验。结果表明,编码reBD-1前原肽和成熟肽的基因序列大小分别为225bp和138bp,目的基因的序列与reBD-1 mRNA序列同源性为100﹪。前原肽和成熟肽融合蛋白分子量分别为28KDa和24KDa。利用琼脂糖扩散法表明0.08 mg /ml的纯化成熟肽蛋白对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的活性有明显抵抗作用。结果显示,reBD-1前原肽及成熟肽的融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。成熟肽融合蛋白对革兰氏阳性菌、阴性菌的活性有抗性,前原肽融合蛋白没有抗菌活性。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
1 引言  10-16
  1.1 抗菌肽简介  10
  1.2 抗菌肽作用  10
  1.3 防御素简介  10-11
  1.4 防御素的种类  11
  1.5 防御素分子结构及表达部位  11-12
    1.5.1 α-防御素  11
    1.5.2 β-防御素  11
    1.5.3 θ-防御素  11
    1.5.4 植物防御素  11-12
    1.5.5 昆虫防御素  12
  1.6 防御素的作用及其机理  12-14
    1.6.1 哺乳动物防御素的作用  12-13
    1.6.2 植物防御素的作用  13-14
    1.6.3 昆虫防御素的作用  14
  1.7 防御素的应用  14-16
    1.7.1 防御素与基因工程  14-15
    1.7.2 防御素与临床应用  15
    1.7.3 防御素的其他应用  15-16
2 pET-32a（+）/reBD-1 原核表达载体的构建  16-31
  2.1 实验材料  16-17
    2.1.1 菌珠  16
    2.1.2 载体及酶  16
    2.1.3 主要试剂  16
    2.1.4 主要实验仪器  16-17
  2.2 实验方法  17-25
    2.2.1 引物  17
    2.2.2 驯鹿总RNA 的提取  17-19
    2.2.3 驯鹿总RNA 的检测  19
    2.2.4 RT-PCR 反转录扩增reBD-1 基因  19-20
    2.2.5 目的片段的回收  20-21
    2.2.6 克隆载体的构建  21-23
    2.2.7 编码reBD-1 成熟肽基因的扩增  23
    2.2.8 原核表达体系的构建  23-25
  2.3 结果  25-30
    2.3.1 总RNA 的检测结果  25-26
    2.3.2 RT-PCR 扩增结果  26-27
    2.3.3 reBD-1 重组质粒的筛选和鉴定  27-28
    2.3.4 reBD-1 重组质粒序列分析  28-29
    2.3.5 reBD-1 成熟肽基因的克隆  29
    2.3.6 pET-32a（+）- reBD-1 重组质粒的鉴定结果  29-30
  2.4 讨论  30-31
    2.4.1 载体及菌株的选择  30-31
    2.4.2 关于reBD-1 成熟肽的特性  31
  2.5 小结  31
3 pET-32a（+）/reBD-1 融合蛋白的表达及纯化  31-44
  3.1 材料  31-32
    3.1.1 菌株与质粒  31
    3.1.2 主要试剂  31-32
    3.1.3 主要实验仪器  32
  3.2 实验方法  32-40
    3.2.1 重组蛋白pET-32a（+）/reBD-1 的诱导表达  32-33
    3.2.2 主要试剂的配制  33
    3.2.3 目的蛋白原核表达及诱导表达条件的优化  33-34
    3.2.4 SDS－PAGE 电泳  34-36
    3.2.5 大量表达靶蛋白  36-37
    3.2.6 目的蛋白的纯化与复性  37-40
  3.3 结果  40-43
    3.3.1 目的蛋白表达条件的优化  40-41
    3.3.2 重组蛋白表达形式的分析  41-42
    3.3.3 目的蛋白的纯化  42-43
  3.4 讨论  43
  3.5 小结  43-44
4 pET-32a（+）/reBD-1 重组蛋白生物活性的研究  44-46
  4.1 材料  44
  4.2 方法  44
  4.3 结果  44-45
  4.4 讨论  45
  4.5 小结  45-46
5 结论  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-54
作者简介  54

驯鹿β-防御素-1（reBD-1）基因的原核表达及蛋白活性的鉴定

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