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‘津田’芜菁MYB类转录因子BrMYB77的克隆及遗传转化

作　者: 阎淑滑
导　师: 李玉花
学　校: 东北林业大学
专　业: 发育生物学
关键词: 津田芜菁 MYB77基因 亚细胞定位 原核表达 转基因番茄
分类号: S631.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


转录因子对植物自身的生长发育及环境等因素的应答反应具有重要的调控作用。MYB类转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一,参与了细胞分化、激素和环境因子应答等生物过程,并对植物次生代谢、花色素形成过程以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。本文以花青素合成光敏感型‘津田’芜菁(Brassica rapa’Tsuda’)为试验材料,通过同源克隆的方法获得一个MYB类转录因子基因,序列比对分析发现与拟南芥MYB77转录因子基因具有很高的同源性,将其命名为BrMYB77基因,并对其进行亚细胞定位等研究,以期为MYB类转录因子的功能研究提供基础。主要研究结果如下：1、通过同源克隆的方法,以‘津田’芜菁幼苗总RNA为模板,RT-PCR扩增得到一个MYB类转录因子基因,序列比对分析发现与拟南芥MYB77转录因子基因具有很高的同源性,将其命名为BrMYB77基因。生物信息学分析表明BrMYB77基因具有两个MYB结构域,是典型的R2R3MYB转录因子基因。2、将BrMYB77基因与荧光蛋白基因融合,构建荧光表达载体GFP-BrMYB77,真空渗透法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达,荧光显微镜观察结果表明,BrMYB77蛋白定位于细胞核。3、将BrMYB77基因插入到pGEX-KG载体中,构建原核表达载体pGEX-BrMYB77, IPTG诱导目的蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western bloting验证GST-BrMYB77融合蛋白的表达。纯化GST-BrMYB77融合蛋白,为进一步研究BrMYB77蛋白的功能奠定了基础。4、利用Gateway技术构建植物表达载体pCAMBIA1301-PMI-BrMYB77载体,通过农杆菌介导的方法转化番茄。通过甘露糖抗性和PCR筛选鉴定阳性苗。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-19
  1.1 植物转录因子研究  9-11
    1.1.1 植物转录因子的特征与种类  9-10
    1.1.2 植物转录因子的研究方法  10-11
  1.2 植物MYB转录因子研究进展  11-14
    1.2.1 植物中的MYB转录因子的结构特征与分类  11-12
    1.2.2 植物MYB转录因子的起源与进化  12
    1.2.3 植物MYB转录因子的功能  12-14
  1.3 无选择标记基因及安全选择标记基因转基因植物研究进展  14-17
    1.3.1 无选择标记基因的转化系统  15-16
    1.3.2 生物安全标记基因研究进展  16-17
    1.3.3 PMI甘露糖转化系统的研究进展  17
  1.4 本项研究目的及意义  17-19
2 津田芜菁MYB转录因子基因的克隆及序列分析  19-28
  2.1 试验材料  19
    2.1.1 植物材料培养及取材  19
    2.1.2 菌种及试剂  19
  2.2 试验方法  19-24
    2.2.1 ‘津田’芜菁总RNA的提取(TRNzol)  19-20
    2.2.2 ‘津田’芜菁MYB基因的克隆  20-24
    2.2.3 津田芜菁MYB序列分析  24
  2.3 结果与分析  24-27
    2.3.1 总RNA电泳及浓度检测  24
    2.3.2 ‘津田’芜菁MYB基因全长克隆  24-27
  2.4 讨论  27
  2.5 本章小结  27-28
3 津田芜菁BrMYB77转录因子的亚细胞定位  28-32
  3.1 试验材料  28
  3.2 试验方法  28-30
    3.2.1 GFP融合表达载体的构建  28-30
    3.2.2 真空渗透法转化洋葱表皮细胞  30
  3.3 结果与分析  30-31
    3.3.1 融合表达载体的构建  30
    3.3.2 重组质粒在洋葱表皮细胞中的瞬时表达  30-31
  3.4 讨论  31
  3.5 本章小结  31-32
4 津田芜菁BrMYB77原核表达诱导及纯化  32-39
  4.1 试验材料  32
  4.2 试验方法  32-36
    4.2.1 引物设计与合成  32
    4.2.2 原核表达载体的构建  32-34
    4.2.3 融合蛋白的诱导表达  34-36
  4.3 结果与分析  36-38
    4.3.1 原核表达载体的构建及鉴定  36
    4.3.2 GST-BrMYB77融合蛋白的表达及SDS-PAGE电泳检测  36-37
    4.3.3 表达产物的纯化及Western印迹检测  37-38
  4.4 讨论  38
  4.5 本章小结  38-39
5 津田芜菁pCAMBIA1301-PMI-BrMYB77表达载体的构建及番茄的遗传转化  39-63
  5.1 试验材料  39-41
    5.1.1 供试菌株、抗生素、质粒和种子  39-40
    5.1.2 酶和试剂  40
    5.1.3 培养基  40-41
  5.2 试验方法  41-50
    5.2.1 植物表达载体pCAMBIA1301-PMI-GW的构建  41-45
    5.2.2 pCAMBIA1301-PMI-BrMYB77植物表达载体的构建  45-47
    5.2.3 pCAMBIA1301-PMI-BrMYB77植物表达载体转化农杆菌  47-48
    5.2.4 甘露糖筛选浓度的确定  48
    5.2.5 农杆菌介导的番茄遗传转化  48-49
    5.2.6 植物基因组DNA的提取  49
    5.2.7 再生植株的PCR检测  49-50
  5.3 结果与分析  50-61
    5.3.1 植物表达载体pCAMBIA1301-PMI-GW的构建  50-55
    5.3.2 pCAMBIA1301-PMI-BrMYB77植物表达载体的构建  55-57
    5.3.3 农杆菌转化菌株的鉴定  57-58
    5.3.4 不同浓度的甘露糖对外植体再生的抑制作用  58-59
    5.3.5 农杆菌介导的番茄遗传转化  59-60
    5.3.6 再生植株PCR检测  60-61
  5.4 讨论  61-62
  5.5 本章小结  62-63
结论  63-64
参考文献  64-70
攻读学位期间发表的学术论文  70-71
致谢  71-72

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 根菜类（直根类） > 芜菁
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