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沙冬青锌指蛋白基因Am6f3与蛋白酶抑制剂基因AmPI的功能研究

作　者: 刘杰
导　师: 卢存福
学　校: 北京林业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 沙冬青 Am6f3 AmPI 转基因非生物胁迫
分类号: S793.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)属豆科沙冬青属,常绿阔叶灌木,主要分布于我国内蒙古阿拉善荒漠地区,具有很强的抗低温、干旱、盐碱、高温胁迫能力,是重要的抗逆基因资源植物,在抗性育种和抗性机理研究方面有重要的意义；由于抗逆性强,根系发达,固沙保土性能好和借助根瘤改善土壤等特性,沙冬青在园林绿化和改善生态环境方面有重要的作用；此外,作为第三纪残遗物种和我国荒漠地区目前唯一的常绿阔叶珍稀濒危树种,沙冬青属于国家重点保护植物,对于研究豆科植物的系统发育、古植物区系、古地理及第三纪气候特征,特别是研究亚洲中部荒漠植物的起源和形成具有较重要的科学价值。本研究选择低温、干旱胁迫沙冬青EST库中锌指蛋白基因Am6f3为研究对象,生物信息学分析发现其属于zf-AN1型锌指蛋白家族中的zf-AN1家族,具有该家族保守的AN1和A20结构域,通过ZF区可以结合Zn2+和靶分子DNA或RNA序列特异性结合,在转录和翻译水平上调控基因的表达,其C末端的α螺旋也可能形成二聚体或者多聚体调控基因的表达。推测该蛋白可能在胁迫条件下作为一个调控因子在转录调控、转录和信号传导中发挥重要作用。实验研究将该基因构建到双元表达载体pBI121上得到植物表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草,并通过抗生素筛选方法初步证明该基因已转入烟草中。在前期通过差减杂交获得的沙冬青蛋白酶抑制剂基因AmPI,并通过pTWIN载体将该基因转入大肠杆菌ER2566的基础上,经异丙基β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE电泳检测发现大肠杆菌ER2566有Mr35×103的目的融合蛋白表达,与预测结果一致。其中以在37℃诱导3h条件下表达量最高,表明目的基因AmPI在大肠杆菌中得到了成功表达。分别测定了低温(4℃)、高温(48℃)、干旱(Mannitol)和盐胁迫(NaCl)条件下,转AmPI大肠杆菌存活率的变化,结果表明在上述非生物胁迫下,同非转基因大肠杆菌相比,转AmPI大肠杆菌的存活率明显提高,可能是AmPI蛋白有助于消除氧自由基,从而对细胞具有保护的作用。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
1 引言  7-25
  1.1 低温胁迫对植物的伤害及植物抗寒性  7-15
    1.1.1 低温对植物的胁迫  7-12
    1.1.2 植物抗寒性的分子基础  12-15
  1.2 转基因提高植物的抗寒性  15-18
    1.2.1 提高生物膜的流动性  15-16
    1.2.2 清除活性氧中间产物  16-17
    1.2.3 渗透调节物质作为低温保护剂  17
    1.2.4 低温信号转录因子调节冷诱导基因表达  17
    1.2.5 低温诱导蛋白  17-18
  1.3 锌指蛋白转录因子及其在植物抗逆上的研究进展  18-21
    1.3.1 锌指蛋白的结构  18
    1.3.2 锌指蛋白的分类  18-19
    1.3.3 锌指蛋白的调控机理  19-20
    1.3.4 锌指蛋白在植物抗逆上的研究和应用  20-21
  1.4 蛋白酶抑制剂研究进展  21-23
  1.5 沙冬青概况及抗寒性研究  23-24
    1.5.1 沙冬青概述  23
    1.5.2 沙冬青的抗寒机理  23-24
  1.6 研究提出的意义  24-25
2 AM6F3基因序列结构与功能预测  25-41
  2.1 分析方法  25-28
    2.1.1 核营酸序列分析  25-26
    2.1.2 蛋白质序列分析  26-28
  2.2 结果  28-39
    2.2.1 核苷酸序列分析  28-30
    2.2.2 蛋白质序列分析  30-39
  2.3 讨论  39-41
3 AM6F3基因对烟草的遗传转化  41-55
  3.1 实验材料  41-43
    3.1.1 植物材料  41
    3.1.2 菌株  41
    3.1.3 主要试剂和仪器  41-42
    3.1.4 PCR扩增引物序列  42
    3.1.5 培养基配方  42-43
  3.2 实验方法  43-50
    3.2.1 35S-AM6F3基因的双元表达载体的构建  43-48
    3.2.2 农杆菌介导的烟草转化  48-50
  3.3 实验结果与分析  50-54
    3.3.1 35S-AM6F3基因双元表达载体的构建  50-53
    3.3.2 农杆菌介导的烟草转化  53-54
  3.4 讨论  54-55
4 转AMPI基因大肠杆菌非生物胁迫抗性的增加  55-69
  4.1 实验材料  55
    4.1.1 菌种  55
    4.1.2 主要试剂和仪器  55
    4.1.3 培养基配方  55
  4.2 实验方法  55-59
    4.2.1 目的蛋白的诱导表达与电泳分析  55-58
    4.2.2 非生物胁迫条件下大肠杆菌存活率的测定  58-59
  4.3 实验结果与分析  59-66
    4.3.1 AMPI的原核表达分析  59-61
    4.3.2 AMPI蛋白对大肠杆菌的保护活性分析  61-66
  4.4 实验讨论  66-69
5 结论与展望  69-71
参考文献  71-77
个人简介  77-79
导师简介  79-81
致谢  81-83
附录  83-84

沙冬青锌指蛋白基因Am6f3与蛋白酶抑制剂基因AmPI的功能研究

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