学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

极地适冷菌Psychrobacter sp.G低温脂肪酶基因克隆与异源表达

作　者: 崔硕硕
导　师: 林学政
学　校: 国家海洋局第一海洋研究所
专　业: 海洋生物学
关键词: 极地微生物 低温脂肪酶 基因克隆与异源表达 分子伴侣 可溶性表达 酶性质
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 53次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


南极是一个终年低温、对生命充满挑战的地方,在这种恶劣环境下生存的微生物经过长期的进化产生了适应低温环境的生命特征,如细胞生物膜的组成变化,蛋白质结构和功能的调整等。南极嗜冷/适冷微生物产生的低温酶具有独特的生理生化特征,即具有极高的催化常数(Kcat)值,同时具有较低和较稳定的米氏常数（Km）值,其主要特征是具有较低的活化能和低温下的酶活力。在某些领域有着中温酶所不可比拟的优越性。本研究通过构建产低温脂肪酶活力较高的南极适冷菌Psychrobacter sp. G的基因组DNA质粒文库,利用鸟枪法克隆到两个包含调控区在内的开放读码框架分别为1452 bp （Lip-1452）和948 bp （Lip-948）的低温脂肪酶全长基因。由基因序列推测的两个脂肪酶的氨基酸序列的N端均包含了以丝氨酸为活性中心的保守五肽（Lip-1452,GDSAG;Lip-948,GNSMG）和保守二肽His-Gly。蛋白序列比对和保守区分析表明,这两个脂肪酶分别属于细菌脂肪酶家族Ⅳ和Ⅴ。将低温脂肪酶基因Lip-1452和Lip-948分别克隆到表达载体pColdⅢ中,并转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）,酶活力测定结果显示基因Lip-948异源表达后酶活力较高。将Lip-948分别克隆到不同的表达载体pColdⅠ、pET32a、pMAL-c4x中,转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）中并进行了诱导表达。SDS-PAGE表明均实现了Lip-948在E. coli的中异源表达,不同表达载体对LIP-948可溶性表达程度有所不同,在上述三种载体中可溶性表达脂肪酶占总脂肪酶蛋白的比例分别为4.5%、18.0%、55.6%;细胞破碎液上清酶活力分别为5.33 U/mL、5.83 U/mL、5.83 U/mL。对重组菌pColdⅢ+ Lip-948/BL21（DE3）产酶条件进行了优化,结果表明,诱导物IPTG最佳终浓度为0.5 mmol/L,诱导时的菌体浓度OD600为0.4-0.6,最佳培养温度为15℃,最佳诱导时间为24 h。将重组质粒pColdⅠ+ Lip-948分别与不同分子伴侣质粒如pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16在E. coli BL21（DE3）中进行了共表达研究。结果表明,与5种不同的分子伴侣共表达能够在不同程度上增加或减少脂肪酶LIP-948的可溶性表达。与分子伴侣质粒pTf16和pGro7共表达后减少LIP-948的可溶性表达,而与编码多个分子伴侣的质粒（pKJE7、pG-Tf2和pG-KJE8）共表达后能提高LIP-948的可溶性表达。当与编码分子伴侣最多的质粒pG-KJE8共表达后,可溶性LIP-948比例达到19.8%,且酶活达到108.77U/mg。通过亲和层析得到了纯化的低温脂肪酶LIP-948,并对其进行了酶学性质研究。结果表明,LIP-948的最适反应温度为35℃,最适pH为8,热稳定性较差,在50℃保温15 min酶活即显著下降;金属离子Sr2+和Ca2+能够显著提高LIP-948的酶活力;该酶更倾向于降解短C链的4-Nitrophenyl底物。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
1 前言  10-25
  1.1 极地微生物与低温酶  10-14
    1.1.1 极地微生物的分类  11
    1.1.2 极地微生物的适冷机制  11-12
    1.1.3 低温酶的化学反应特征  12-13
    1.1.4 低温酶的分子结构假说  13-14
  1.2 低温脂肪酶  14-24
    1.2.1 脂肪酶简介  14-15
    1.2.2 低温脂肪酶来源及克隆  15-17
    1.2.3 低温脂肪酶的异源表达  17-23
    1.2.4 低温脂肪酶的应用  23-24
  1.3 本课题的研究目的和意义  24-25
2 Psychrobacter sp. G 基因组DNA 质粒文库的构建与低温脂肪酶基因的克隆  25-40
  2.1 材料与方法  25-29
    2.1.1 菌株与试剂  25
    2.1.2 基因组DNA 提取  25-26
    2.1.3 基因组DNA 酶切  26-27
    2.1.4 基因组DNA 片段与pUC118 HincⅡ/BAP 载体连接  27
    2.1.5 连接产物转化  27-28
    2.1.6 菌落PCR 检测和测序验证  28
    2.1.7 产低温脂肪酶阳性克隆的筛选  28
    2.1.8 产低温脂肪酶基因序列分析  28-29
  2.2 结果  29-37
    2.2.1 基因组DNA 电泳检测  29
    2.2.2 菌落PCR 检测和测序验证  29-30
    2.2.3 南极适冷菌Psychrobacter sp. G 低温脂肪酶基因的序列分析  30-36
    2.2.4 低温脂肪酶的3D 结构预测  36-37
  2.3 讨论  37-39
  2.4 小结  39-40
3 异源表达载体的筛选及分子伴侣共表达  40-65
  3.1 材料与方法  40-51
    3.1.1 菌株和质粒  40-41
    3.1.2 重组质粒构建相关试剂  41
    3.1.3 核酸电泳相关试剂  41-42
    3.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂  42
    3.1.5 Western blot 相关试剂  42-43
    3.1.6 原核表达载体的构建  43-46
    3.1.7 重组菌的诱导表达及异源表达载体的筛选  46
    3.1.8 重组菌的诱导表达及最佳诱导条件的探索  46-47
    3.1.9 脂肪酶酶活检测及蛋白浓度测定  47-48
    3.1.10 SDS-PAGE 检测蛋白表达  48-49
    3.1.11 分子伴侣共表达  49-50
    3.1.12 Western blot 检测  50-51
  3.2 结果  51-61
    3.2.1 产低温脂肪酶重组菌的构建  51-52
    3.2.2 低温脂肪酶基因Lip-1452 克隆到pColdⅢ载体中的表达  52-53
    3.2.3 低温脂肪酶基因Lip-948 在pColdⅢ载体中的表达  53-54
    3.2.4 低温脂肪酶基因Lip-948 在pColdⅠ载体中的表达  54
    3.2.5 低温脂肪酶基因Lip-948 在pMAL-c4x 载体中的表达  54-55
    3.2.6 低温脂肪酶基因Lip-948 在pET32a 载体中的表达  55-56
    3.2.7 最佳诱导表达条件探索  56-59
    3.2.8 分子伴侣共表达  59-61
  3.3 讨论  61-63
  3.4 小结  63-65
4 低温脂肪酶LIP-948 的分离纯化与酶学性质研究  65-74
  4.1 材料与方法  65-67
    4.1.1 菌株和试剂  65
    4.1.2 重组脂肪酶的纯化  65-66
    4.1.3 重组脂肪酶酶学性质  66-67
  4.2 结果与分析  67-71
    4.2.1 低温脂肪酶pColdⅠ+Lip-948 的纯化  67-68
    4.2.2 温度对酶活的影响  68-69
    4.2.3 pH 对酶活的影响  69-70
    4.2.4 金属离子对酶活的影响  70
    4.2.5 底物特异性  70-71
  4.3 讨论  71-73
  4.4 小结  73-74
5 总结与展望  74-77
  5.1 总结  74-75
  5.2 展望  75-77
参考文献  77-86
硕士期间发表文章  86-87
致谢  87

相似论文

  1. Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
  2. α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究,TQ925
  3. VP3融合蛋白结构的改变影响其诱导人肝癌细胞凋亡活性,R735.7
  4. 人BCMA基因的克隆、表达及抗体制备,R392.1
  5. 深海嗜冷杆菌低温脂肪酶基因的克隆表达、酶的纯化及性质研究,Q78
  6. 木聚糖酶出发菌株的研究及酶性质的考察,Q814
  7. 保守GTP酶的分子伴侣活性研究,Q55
  8. 胆固醇氧化酶的异源表达和应用研究,Q814
  9. 内含肽介导的重组鹅IFN-α在大肠杆菌中的可溶性表达及其抗病毒活性鉴定,Q78
  10. 分子伴侣Jiv90的原核表达及其功能的初步研究,Q75
  11. 纳米二氧化硅介入对酶活性、酪蛋白磷酸肽制备以及活性保护的影响,TQ127.2
  12. 天山冻土低温微生物多样性及产低温脂肪酶菌株系统发育分析,S154.3
  13. 大肠杆菌和无细胞蛋白合成系统中的可溶性表达策略,Q78
  14. SET/TAF-Iβ和CHMP6的克隆、表达、纯化以及初步晶体学分析,Q78
  15. 低温脂肪酶的筛选、纯化及特性研究,Q814
  16. 产低温碱性脂肪酶菌株的筛选及酶学性质研究,TQ925
  17. 黑尾近红鲌消化酶活性分布及其性质研究,S917.4
  18. 猪硫氧还蛋白与IFN-α融合表达及其抗猪圆环病毒2活性,S852.65
  19. 分子伴侣DJ-1与小肽协同抑制α-突触核蛋白的聚集,Q78
  20. 共表达PDI提高IFNβ-HSA在毕赤酵母中表达的研究,Q78
  21. 低温脂肪酶产生菌的筛选及发酵工艺研究,TQ920

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com