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产低温碱性脂肪酶菌株的筛选及酶学性质研究

作　者: 刘瑞娟
导　师: 王海宽
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 筛选伯克霍尔德氏菌碱性脂肪酶低温脂肪酶分离纯化洗涤剂
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本论文从渤海湾盐碱地被油污染的土样中筛选出一株产低温碱性脂肪酶的菌株34-5,对该菌株的产酶发酵培养基、发酵条件进行了优化,并对菌株34-5所产脂肪酶的纯化工艺和酶学性质进行了研究。以橄榄油为唯一碳源,在25℃和pH 9.6的低温碱性条件下,分离出354株脂肪酶产生菌。采用平板扩散方法定性检测酶活,通过改变平板的pH值和平板反应温度,筛选出51株产碱性脂肪酶的菌株,8株产低温碱性脂肪酶,其中菌株34-5所产脂肪酶的最适温度为25℃,最适pH为9.6。该菌的16S rDNA基因序列与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)的同源性为99%。摇瓶实验表明,菌株34-5最适产酶培养基为(g／L)：淀粉10,黄豆饼粉20,玉米浆20, K2HPO4 1,聚乙烯醇大豆油乳化液20,最适产酶温度28℃,最佳产酶pH 9.0,发酵44 h达到产酶高峰,低温碱性脂肪酶的酶活达到7.67 U／mL。对菌株34-5产的低温碱性脂肪酶进行了分离纯化,菌体发酵液经过离心、硫酸铵沉淀、DEAE-52离子交换和Sephadex G-75凝胶过滤等步骤处理,经电泳检测达到电泳纯。对菌株34-5所产脂肪酶进行酶学性质研究,该酶的最适温度和pH为30℃,pH 9.0,该酶在10、15、20和25℃时分别保持63、66、74和95%的活性。洗涤剂、柠檬酸钠、牛黄胆酸钠、甘氨酸和NaCl等溶剂对该脂肪酶的激活作用较强；TritonX-100, Tween-20, Tween-80, SDS及皂角苷等溶剂对该脂肪酶有微弱的抑制作用；该脂肪酶对氧化剂(过氧化氢、NaClO3、过硼酸钠)有较好的稳定性；碱性蛋白酶、硼砂、洗衣粉等溶剂的浓度对脂肪酶的活性影响较大,其高浓度抑制脂肪酶活性,低浓度促进脂肪酶活性。结果显示,菌株34-5所产脂肪酶为低温碱性脂肪酶,具有较好的洗涤剂添加剂方面的应用潜力。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-22
  1.1 脂肪酶的研究背景及意义  9-10
    1.1.1 低温碱性脂肪酶的简介  9
    1.1.2 脂肪酶的研究背景  9-10
  1.2 脂肪酶的性质  10-11
    1.2.1 作用机理  10-11
    1.2.2 反应类型  11
    1.2.3 底物特异性  11
  1.3 脂肪酶活力的测定  11-12
  1.4 低温碱性脂肪酶的用途  12-16
    1.4.1 洗涤添加剂  13-14
    1.4.2 药物  14
    1.4.3 食品加工  14
    1.4.4 油脂工业  14-15
    1.4.5 皮革脱脂  15
    1.4.6 造纸  15-16
    1.4.7 化妆品  16
    1.4.8 制备化工产品和试剂  16
    1.4.9 手性化合物制备  16
  1.5 碱性脂肪酶的研究现状  16-19
    1.5.1 国外碱性脂肪酶的发展状况  16-17
    1.5.2 我国碱性脂肪酶的发展现状  17-19
  1.6 本课题的立体依据  19-20
  1.7 研究内容  20-22
2 材料与方法  22-31
  2.1 实验材料  22-26
    2.1.1 菌种  22
    2.1.2 主要试剂  22-23
    2.1.3 仪器和设备  23-24
    2.1.4 培养基  24-25
    2.1.5 溶液  25-26
  2.2 实验方法  26-31
    2.2.1 测酶活方法  26-27
    2.2.2 酶纯度的分析及分子量的测定方法  27-28
    2.2.3 产脂肪酶菌株的分离  28
    2.2.4 菌株34-5的生理生化鉴定及16SrDNA序列测定  28-29
    2.2.5 脂肪酶的初步纯化工艺  29
    2.2.6 相对酶活力的计算  29-31
3 结果与讨论  31-51
  3.1 产脂肪酶菌株的分离  31-33
  3.2 菌株34-5的生理生化鉴定及16SrDNA序列结果  33-36
  3.3 菌株34-5产酶发酵培养基的优化  36-40
    3.3.1 碳源对菌株34-5产酶的影响  36
    3.3.2 氮源对菌株34-5产酶的影响  36-37
    3.3.3 诱导剂对菌株34-5产酶的影响  37-39
    3.3.4 pH对菌株34-5产酶的影响  39
    3.3.5 Ca~(2+)和Mg~(2+)对菌株34-5产酶的影响  39-40
  3.4 发酵条件的优化  40-41
    3.4.1 发酵温度对菌株34-5产酶的影响  40
    3.4.2 发酵时间对菌株34-5产酶的影响  40-41
    3.4.3 装液量对菌株34-5产酶的影响  41
  3.5 脂肪酶的初步纯化  41-45
    3.5.1 硫酸铵沉淀  41-42
    3.5.2 透析脱盐  42-43
    3.5.3 DEAE-52离子交换层析  43
    3.5.4 Sephadex G-75凝胶过滤层析  43
    3.5.5 低温碱性脂肪酶的纯度鉴定及分子量测定  43-44
    3.5.6 低温碱性脂肪酶的纯化回收情况  44-45
  3.6 酶学性质  45-51
    3.6.1 最适温度  45-46
    3.6.2 温度稳定性  46-47
    3.6.3 最适pH  47
    3.6.4 pH稳定性  47-48
    3.6.5 洗涤剂成分对脂肪酶活性的影响  48-51
4 结论  51-52
5 展望  52-53
6 参考文献  53-60
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  60-61
8 致谢  61

产低温碱性脂肪酶菌株的筛选及酶学性质研究

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