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芽孢杆菌高产赖氨酸突变株的选育及代谢途径初步研究

作　者: 王震宇
导　师: 杨谦
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 遗传学
关键词: 短小芽孢杆菌 高产赖氨酸 诱变育种 天冬氨酸激酶 代谢途径
分类号: TQ922.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


蛋白质资源的短缺已经成为一个世界性问题,因此新型蛋白质资源的开发以及蛋白质利用效率的提高成为研究的热点。单细胞蛋白因其营养丰富,生产速率高,原料来源广泛等特点而成为重要的蛋白质来源。赖氨酸作为动物和人体第一限制性氨基酸,提高其在蛋白质资源中的含量能够很大程度上提高蛋白质的利用效率。因此,本文通过对单细胞蛋白生产菌株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)D8进行紫外诱变和溴化乙锭诱变,并通过6.0 mg/mL的赖氨酸结构类似物AEC进行抗性筛选,得到具有赖氨酸反馈抑制抗性的突变菌株E1,其基本培养基发酵产物中赖氨酸含量达到50.83 mg/mL,比原始出发菌株的34.79 mg/mL提高了46.11%。应用基因克隆技术和基因测序,分别得到了原始出发菌株D8和突变株E1的天冬氨酸激酶lysC基因。对原始出发菌株D8的天冬氨酸激酶(AK)进行生物信息学分析得出该蛋白由1230 bp的核苷酸序列编码,共409个氨基酸残基,分子量43.66 kDa,理论等电点4.89,不含信号肽。lysC基因的全长编码天冬氨酸激酶α亚基,从基因的第778个碱基开始编码天冬氨酸激酶的β亚基。α亚基中含有一个天冬氨酸磷酸化催化核心和两个对赖氨酸、苏氨酸敏感的小分子结合域(ACT domain);β亚基中只含有两个对赖氨酸、苏氨酸敏感的小分子结合域。在原始出发菌株D8和突变株E1的天冬氨酸激酶对比中,发现了自第783～826位碱基的移码突变,造成了第261～276位氨基酸的替换,以及第374位氨基酸由谷氨酸到缬氨酸的改变,推测两者可能是天冬氨酸激酶产生抗赖氨酸反馈抑制的原因。对突变株中AK三维结构的研究发现突变株中的两个ACT domain与催化核心的相对位置发生显著改变,β折叠区域的连贯性被打破。在没有发现突变株存在氨基酸营养缺陷型的条件下,预测天冬氨酸激酶基因突变造成蛋白质结构的改变使其具有赖氨酸反馈抑制抗性是高产赖氨酸的直接原因。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章 绪论  8-21
  1.1 研究背景  8-10
  1.2 国内外研究现状  10-19
    1.2.1 单细胞蛋白的研究进展  10-11
    1.2.2 高产赖氨酸突变株的选育  11-14
    1.2.3 天冬氨酸激酶  14-16
    1.2.4 微生物诱变育种  16-19
  1.3 课题来源及主要研究内容  19-21
    1.3.1 课题来源  19
    1.3.2 主要研究内容  19-21
第2章 实验材料和实验方法  21-31
  2.1 实验材料  21-23
    2.1.1 实验菌种  21
    2.1.2 培养基  21
    2.1.3 实验设备与仪器  21-22
    2.1.4 实验药品  22
    2.1.5 实验试剂  22-23
    2.1.6 引物设计及相关软件  23
  2.2 实验方法  23-30
    2.2.1 短小芽孢杆菌生长曲线的测定  23-24
    2.2.2 短小芽孢杆菌AEC 最低抑制浓度的确定  24
    2.2.3 短小芽孢杆菌的紫外诱变  24
    2.2.4 短小芽孢杆菌溴化乙锭诱变  24-25
    2.2.5 发酵产物的赖氨酸分析  25-26
    2.2.6 天冬氨酸激酶基因及序列的获得  26-30
  2.3 本章小结  30-31
第3章 高产赖氨酸突变株的获得  31-38
  3.1 短小芽孢杆菌生长曲线的测定  31-32
  3.2 赖氨酸结构类似物AEC 抗性筛选浓度的确定  32-33
  3.3 短小芽孢杆菌的紫外诱变  33-34
  3.4 短小芽孢杆菌的溴化乙锭诱变  34-35
  3.5 发酵产物中赖氨酸含量的测定  35-37
    3.5.1 赖氨酸含量标准曲线的绘制  35-36
    3.5.2 突变株发酵产物赖氨酸含量的测定  36-37
  3.6 本章小结  37-38
第4章 突变株E1 的赖氨酸合成代谢途经初步研究  38-50
  4.1 短小芽孢杆菌lysC 基因的获得及生物信息学分析  38-43
    4.1.1 短小芽孢杆菌基因组的提取  38
    4.1.2 短小芽孢杆菌D8 天冬氨酸激酶基因的获得  38-39
    4.1.3 目的片段连接克隆载体及测序结果  39-40
    4.1.4 信号肽的预测  40-41
    4.1.5 蛋白质功能域的预测  41-42
    4.1.6 天冬氨酸激酶的三维结构  42-43
  4.2 突变株E1 的赖氨酸合成途经分析  43-49
    4.2.1 突变株E1 中lysC 基因的获得及序列比对分析  43-46
    4.2.2 突变株E1 中天冬氨酸激酶的三维结构  46-47
    4.2.3 突变株E1 发酵产物中其他氨基酸代谢的分析  47-49
  4.3 本章小结  49-50
结论  50
展望  50-51
参考文献  51-57
攻读学位期间发表的学术论文  57-59
致谢  59

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制氨基酸 > 赖氨酸
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