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诺西肽发酵工艺的研究

作　者: 韩果红
导　师: 何建勇；白秀峰
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 活跃链霉菌诺西肽发酵工艺补料
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 202次
引　用: 3次
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内容摘要

本论文对诺西肽产生菌—活跃链霉菌及其发酵工艺条件进行了深入的研究，主要目的是优化诺西肽的发酵生产工艺，以适用于工业化生产的需要。本论文首先通过自然分离确定了出发菌株YM4—2，然后，经过对培养基的初步考察，确定了适合该菌生长的分离（斜面）及种子培养基。为了对活跃链霉菌的代谢产物诺西肽及其他相关物质进行定性和定量分析，在大量实验的基础上，建立了诺西肽萃取的工艺条件和检测发酵液中诺西肽含量的微生物效价测定法、薄层层析—紫外及生物显影法和高效液相色谱法。通过试验建立了活跃链霉菌YM4—2最适的摇瓶发酵工艺条件：最适培养温度28～30℃，发酵周期4～5天，种龄27小时，接种量2.5～5％，装瓶量30ml／250ml三角瓶，发酵培养基消前pH为6.6～7.0。本论文对发酵培养基进行了细致的考察。通过对碳源、氮源的考察确定了最适碳源为水解淀粉，最适氮源为黄豆粉。并利用均匀设计法对发酵培养基的组成进行了优化，利用该条件绘制了活跃链霉菌的代谢曲线。通过对补料工艺的考察进一步提高了诺西肽的产量。本论文还考察了各种氨基酸对诺西肽生物合成的影响。丝氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠对诺西肽的生物合成有明显的促进作用。半胱氨酸主要是通过促进次级代谢从而提高诺西肽的产量。初步考察了NH₄⁺对诺西肽生物合成的抑制作用机制。最后还通过薄层色谱法、高效液相色谱法和质谱法证明了发酵产物为诺西肽。

全文目录

中文摘要  9-10
英文摘要  10-12
第一章前言  12-27
  1.1 诺西肽产生菌  13-14
    1.1.1 诺西肽产生菌的发现  13-14
    1.1.2 产生菌的特征  14
  1.2 诺西肽的化学结构和理化性质  14
  1.3 诺西肽的抗菌作用机制  14-16
  1.4 诺西肽的生物合成  16-17
  1.5 抗性和生物合成基因  17-19
  1.6 提高诺西肽产量的可能途径  19-20
  1.7 诺西肽的生产工艺  20-26
    1.7.1 诺西肽的发酵  20-21
    1.7.2 诺西肽的提取分离与精制  21-23
    1.7.3 诺西肽的检测方法  23-26
  1.8 国内外研究进展  26-27
第二章材料与方法  27-42
  2.1 实验材料  27-30
    2.1.1 菌种  27
    2.1.2 培养基  27-29
    2.1.3 试剂  29-30
    2.1.4 试验仪器与软件  30
  2.2 实验方法  30-42
    2.2.1 诺西肽产生菌的菌种选育  30-32
    2.2.2 诺西肽的定性与定量测定  32-36
    2.2.3 代谢参数的测定  36-42
第三章实验结果与讨论  42-91
  3.1 出发菌株最适斜面及分离培养基的考察  42-43
    3.1.1 分离培养基的考察  42
    3.1.2 斜面培养基的考察  42-43
  3.2 高产菌株选育方法的建立  43-44
  3.3 菌种保藏方法的考察  44-45
  3.4 培养条件对产孢子能力的影响  45-46
  3.5 传代稳定性及保藏稳定性考察  46-47
    3.5.1 传代稳定性的考察  46-47
    3.5.2 斜面保藏稳定性考察  47
  3.6 检测方法的研究与建立  47-54
    3.6.1 生物效价测定法  47-48
    3.6.2 薄层层析-紫外光定位法及生物显影法  48-49
    3.6.3 紫外分光光度法  49-50
    3.6.4 高效液相色谱法  50-54
  3.7 HPLC峰位与TLC斑点的对应性考察  54-56
  3.8 种子培养基和种龄的初步考察  56-59
    3.8.1 种子培养基的考察  56
    3.8.2.种龄的考察  56-59
  3.9 发酵培养基的考察  59-67
    3.9.1 碳源的考察  59-60
    3.9.2 氮源的考察  60-61
    3.9.3 碳、氮源综合考察  61-62
    3.9.4 无机盐作用的考察  62-65
    3.9.5 微量元素作用的考察  65-66
    3.9.6 培养基初始pH的考察  66-67
  3.10 发酵条件的考察  67-69
    3.10.1 接种量的考察  67-68
    3.10.2 通气量的考察  68
    3.10.3 发酵周期的考察  68-69
  3.11 菌株的代谢曲线  69-71
  3.12 补料工艺的考察  71-74
    3.12.1 碳源补料工艺的考察  71-73
    3.12.2 氮源补料及复合补料工艺的考察  73-74
  3.13.氨基酸作用的考察  74-79
    3.13.1 各种氨基酸作用的综合考察  74-76
    3.13.2 丝氨酸、谷氨酸等几种氨基酸添加时间的考察  76-77
    3.13.4 半胱氨基酸作用的考察  77-79
  3.14 葡萄糖、NH_4~+对诺西肽合成的抑制作用及机制探讨  79-83
    3.14.1 葡萄糖的作用  79-80
    3.14.2 NH_4~+的作用  80-83
  3.15 诺西肽萃取条件的考察  83-84
    3.15.1.萃取剂的选择  83-84
    3.15.2.萃取时间的考察  84
    3.15.3.萃取温度的考察  84
  3.16 发酵产物的鉴定  84-91
    3.16.1 诺西肽的提取与精制  84-85
    3.16.2 薄层层析法  85
    3.16.3 HPLC法  85-87
    3.16.4 质谱法  87-91
第四章讨论  91-95
第五章结论  95-97
参考文献  97-102
致谢  102-103

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