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氯氰菊酯降解菌株CDT3、PBM11的分离、降解特性及协同代谢研究

作　者: 许育新
导　师: 李顺鹏
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 氯氰菊酯 3-苯氧基苯甲酸 降解菌 降解途径 协同代谢 酯酶
分类号: X172
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 529次
引　用: 3次
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内容摘要


拟除虫菊酯类杀虫剂是一类人工合成的，类似天然除虫菊素的化合物。氯氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂的一种，虽然氯氰菊酯被认为是高效低毒的农药，但是，氯氰菊酯具有对光、热稳定的特点，在环境中的半衰期较长，很难在自然条件下快速降解，造成了作物和土壤中此类农药的大量残留，给人们的健康带来了巨大的威胁。农药残留降解菌技术具有高效、无毒、无二次污染的特点，而且经济实用，操作简便，目前已成为去除农药残留污染的一种重要方法。 从农药厂污泥中分离到一株氯氰菊酯的降解菌，命名为CDT3。经生理生化试验和16SrDNA序列分析，CDT3被鉴定为红球菌属（Rhodococcus sp.）。CDT3在摇瓶中对100mg/L氯氰菊酯72h降解效率达到84.24％。在温度30℃，pH8.0时，CDT3对氯氰菊酯的降解率最高。CDT3可以降解200mg/L的氯氰菊酯，是目前单株菌降解拟除虫菊酯的最高浓度。CDT3不能利用氯氰菊酯生长，以共代谢的方式降解氯氰菊酯。添加少量葡萄糖、蛋白胨、酵母汁均能促进它对氯氰菊酯的降解。小区试验中对茶叶上氯氰菊酯的降解率达到68.94％。研究了CDT3降解氯氰菊酯的代谢途径，通过GC-MS分析，证实氯氰菊酯被CDT3降解后的中间产物是3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）和二氯菊酸（DCVA），推测氯氰菊酯是由CDT3产生的酯酶降解的。 从农药厂污泥中分离了一株3-苯氧基苯甲酸（3-Phenoxybenzoicacid，3-PBA）降解菌株PBM11。经生理生化试验和16SrDNA测定初步鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。PBM11可以利用3-PBA生长，氯氰菊酯经CDT3和PBM11的联合降解后，检测不到氯氰菊酯和3-PBA的残留。PBM11在pH7.0，30℃，24h可矿化200mg/L的3-PBA；添加低浓度的营养物质能够促进降解。Cu2+和Co2+等对其降解有抑制作用，而Fe3+有明显的促进作用；通过分析底物利用情况，推测PBM11首先在1，2-双加氧酶的作用下将3-PBA降解为原二茶酸（3，4-二羟基苯甲酸）和苯酚。经过7d的处理，PBM11对土壤中100mg/L3-PBA的降解率为66.25％。从PBM11中检测到一个质粒。 研究了CDT3和PBM11协同作用对氯氰菊酯的降解，结果表明50mg／L的3-PBA会明显抑制CDT3的生长，3-PBA会对CDT3降解氯氰菊酯产生反馈抑制，

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
符号与缩略语说明  13-14
前言  14-15
文献综述  15-45
  第一章 农药污染和生物修复技术  15-32
    1. 农药的污染  15-17
    2. 生物修复技术概况  17-18
    3. 生物修复技术的分类  18-23
      3.1 原位生物修复技术  19-22
      3.2 异位生物修复技术  22-23
    4. 生物修复技术的影响因素  23-26
      4.1 污染物的生物可利用性(bioavilibility)  23
      4.2 生物活性(bioactivity)  23-24
      4.3 环境因素  24-26
    5. 微生物降解有毒化合物的方式  26-27
      5.1 氧化作用  26-27
      5.2 还原作用  27
      5.3 水解作用  27
      5.4 缩合或共轭形式  27
    6. 典型有机化合物的生物降解  27-32
      6.1 芳香族有机化合物的降解  27-29
      6.2 拟除虫菊酯类农药的微生物降解  29-32
  第二章 生物修复中的分子生物学  32-45
    1 未培养微生物(unculturable microorganism，UCM)的研究  32-33
    2 分子生物学方法  33-40
      2.1 环境微生物群落DNA的提取  33-34
      2.2 标记核酸探针杂交技术  34
      2.3 原位荧光杂交技术(fluorescent in situ hybridazation，FISH)  34-35
      2.4 基于PCR技术的研究方法  35-36
      2.5 微生物基因组中特异DNA片段的序列分析  36-37
      2.6 DNA扩增片段电泳检测技术  37
      2.7 宏基因组(metagenome)文库的构建和应用  37-38
      2.8 生物芯片  38-39
      2.9 报道基因  39
      2.10 生物修复中的应用  39-40
    3. 可移动遗传元件(MGEs)和水平基因转移(HGT)  40-45
研究报告  45-115
  第一章 氯氰菊酯降解菌株CDT3的分离和降解特性研究  45-68
    第一节 氯氰菊酯降解菌的分离、鉴定  45-56
      1. 材料与方法  45-49
        1.1 培养基与试剂  45-46
        1.2 仪器  46
        1.3 降解菌的分离与鉴定  46-48
        1.4 CDT3对氰氯菊酯的降解试验  48
        1.5 CDT3最适生长条件研究  48-49
        1.6 CDT3的抗生素抗性试验  49
        1.7 农药检测方法  49
      2. 结果及讨论  49-56
        2.1 菌株分离与鉴定  49-51
        2.2 菌株的系统进化分析  51-52
        2.3 生长曲线测定  52-53
        2.4 降解性能的验证  53-54
        2.5 生长条件的研究  54-56
    第二节 氯氰菊酯降解菌株CDT3的降解特性  56-62
      1 材料与方法  56-57
        1.1 菌株  56
        1.2 培养基和试剂  56
        1.3 仪器  56
        1.4 CDT3降解氯氰菊酯的特性研究  56-57
        1.5 茶叶降解试验  57
        1.6 氯氰菊酯残留检测方法  57
      2 结果与讨论  57-62
        2.1 降解曲线的测定  57-58
        2.2 接种量与降解率的关系  58-59
        2.3 CDT3菌株的共代谢的研究  59
        2.4 最佳降解条件  59-61
        2.5 CDT3对氯氰菊酯的耐受性实验  61
        2.6 茶叶降解试验结果  61-62
    第三节 CDT3降解氯氰菊酯的途径  62-68
      1 材料与方法  62-63
        1.1 材料  62
        1.2 氯氰菊酯的降解产物和降解途径分析  62-63
      2 结果与讨论  63-66
        2.1 降解产的气相色谱检测  63-64
        2.2 降解产物的GC-MS分析和降解途径推测  64-66
      3. 讨论  66-68
  第二章 3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)降解菌株PBM11的分离和降解特性研究  68-79
    1 材料与方法  68-71
      1.1 培养基和试剂  68
      1.2 仪器  68-69
      1.3 菌株的富集与分离  69
      1.4 菌株的鉴定  69
      1.5 PBM11 16S rDNA序列的系统进化分析  69
      1.6 PBM11 对3-PBA的降解试验  69
      1.7 3-PBA的检测方法  69-70
      1.8 CDT3和PBM11联合作用对氯氰菊酯的降解  70
      1.9 环境因素对降解的影响  70
      1.10 底物利用试验  70
      1.11 PBM11土壤降解试验  70-71
      1.12 PBM11质粒的提取  71
    2 结果与讨论  71-78
      2.1 菌种分离与鉴定  71-72
      2.2 PBM11降解性能验证  72-73
      2.3 CDT3和PBM11联合作用对氯氰菊酯的降解  73-74
      2.4 环境因素对3-PBA降解的影响  74-76
      2.5 底物利用谱和降解途径推测  76-77
      2.6 土壤污染处理试验  77-78
      2.7 质粒的提取  78
    3 讨论  78-79
  第三章 CDT3和PBM11协同作用降解氯氰菊酯研究  79-90
    第一节 CDT3和PBM11协同降解关系的研究  79-84
      1 材料与方法  79-80
        1.1 菌株  79
        1.2 培养基和试剂  79-80
        1.3 仪器  80
        1.4 农药的提取与检测  80
      2. 结果及讨论  80-83
        2.1 3-PBA对CDT3的生长的影响  80-81
        2.2 氯氰菊酯对PBM11的生长的影响  81
        2.3 加入PBA对CDT3降解氯氰菊酯的影响  81-82
        2.4 CDT3和PBM11降解氯氰菊酯的最适比例  82
        2.5 CDT3和PBM11的接种时间对氯氰菊酯降解与菌株生长的影响  82-83
      3. 讨论  83-84
    第二节 CDT3和PBM11协同降解土壤中氯氰菊酯及其中间产物3-PBA的研究  84-90
      1 材料与方法  84-86
        1.1 供试土壤  84
        1.2 菌液  84
        1.3 培养基  84-85
        1.4 试剂和仪器  85
        1.5 土壤中协同降解试验方法  85
        1.6 农药的提取和检测  85
        1.7 土壤中微生物结构的分析  85
        1.8 土壤细菌16SrDNA V3区DGGE分析  85-86
      2. 结果与分析  86-88
        2.1 土壤中氯氰菊酯和3-PBA的降解试验  86
        2.2 氯氰菊酯污染和施加降解菌对土壤微生物群落结构的影响  86-88
      3. 讨论  88-90
  第四章 CDT3中氯氰菊酯降解酶研究和酯酶基因(cesA)的克隆  90-115
    第一节 CDT3中降解酶活性研究  90-98
      1. 材料与方法  90-92
        1.1 菌种及来源  90
        1.2 试剂与仪器  90
        1.3 实验方法  90-92
      2. 结果及分析  92-97
        2.1 降解酶液的提取  92
        2.2 CDT3降解酶的酯酶活性初步分析  92-93
        2.3 降解酶酶反应体系的建立  93-94
        2.4 降解酶的定位  94-95
        2.5 降解酶活性的初步研究  95-97
      3. 讨论  97-98
    第二节 CDT3中的酯酶基因(cesA)的克隆和序列分析  98-115
      1. 材料与方法  98-105
        1.1 菌株与质粒  98
        1.2 培养基和试剂  98-99
        1.3 感受态细胞的制备  99-100
        1.4 酶切体系建立  100-101
        1.5 试剂盒回收酶切片段  101
        1.6 载体脱磷  101-102
        1.7 酶连  102-103
        1.8 转化  103
        1.9 CDT3基因文库的构建  103
        1.10 阳性转化子的筛选  103
        1.11 蛋白质电泳分析  103-104
        1.12 序列分析方法  104-105
      2 结果与讨论  105-114
        2.1 CDT3染色体总DNA的提取及Sau3AI酶切  105-106
        2.2 染色体文库的建立及文库质量的检验  106-107
        2.3 阳性克隆的获得  107-108
        2.4 序列测定  108-109
        2.5 阳性克隆的ORF分析  109
        2.6 cesA结构基因分析  109
        2.7 cesA序列分析  109-113
        2.8 cesA酯酶的功能验证  113
        2.9 PRT1转化子的总蛋白分析  113-114
      3 讨论  114-115
全文总结  115-117
本论文的创新之处  117-118
参考文献  118-133
附录Ⅰ 文中所用的试剂及培养基配方  133-136
附录Ⅱ 文中核酸序列  136-139
攻读博士期间发表及已录用的论文  139-140
致谢  140

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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