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染色法对奶牛舍气载微生物含量的检测及其真菌气溶胶传播的鉴定

作　者: 刘敬博
导　师: 柴同杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 奶牛舍微生物气溶胶浓度培养法与染色法真菌气源性传播须癣毛癣菌 IGS-RFLP
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

深入了解奶牛舍环境中微生物气溶胶的浓度及其环境中真菌气溶胶的传播机制,为奶牛场的科学管理提供提第一手的资料。本研究于2009～2010在山东省泰安市、济宁汶上县、山东淄博高青5个奶牛场,采用AGI-30空气采样器采集空气样品。传统培养法以营养琼脂培养基培养需氧菌,并确定可培养细菌的浓度;以沙堡弱培养基培养真菌,并确定可培养的真菌浓度。相对比的,采用DNA染色法以DNA染料(DAPI)为介质进行DNA染色,通过DNA染料能发荧光的特性,在荧光显微镜下可以直接计数,从而确定气载微生物的浓度。进而比较这两种方法的检测奶牛舍环境中微生物气溶胶浓度差异。与此同时,采用ANDERSEN-6级空气样品采样器,以沙堡弱培养基为介质采集空气样品,同时采集舍内的牛粪和病牛病灶的结痂。然后,将收集到的空气样品、牛粪和结痂在沙堡弱培养基进行培养,形态学鉴定后确定出皮肤病原真菌—须癣毛癣菌,再提取病原真菌的DNA进行IGS区段PCR和RFLP。最后,进行同源性分析,确定皮肤病原真菌形成气溶胶并气源性传染的事实。研究结果表明,培养计数法测得五个牛舍内微生物气溶胶(细菌和真菌)的浓度(平均值)分别为:38.9×10~5cfu/m~3、27.1×10~5cfu/m~3、26.3×10~5cfu/m~3、2.09×10~5cfu/m~3、5.92×10~5cfu/m~3,DAPI染色法所测的5个牛舍内微生物气溶胶的含量(平均值)分别为:166×10~6 cell/m~3,166×10~6 cell/m~3,136×10~6 cell/m~3,0.836×10~6 cell/m~3,3.73×10~6 cell/m~3空气。DAPI染色计数法所测气载微生物的含量约是培养计数法的9.6～2500倍。统计学分析表明,DAPI染色计数的结果与直接培养计数结果相比,差异极显著(P<0.01)。本研究利用真菌通用引物扩增出了须癣毛癣菌IGS保守序列,并利用限制性内切酶MspⅠ、PstⅠ和XhoⅠ进行酶切。根据MspⅠ酶切片段发现粪便和病料中分离到的某些须癣毛癣菌的RFLP图谱相同,并且与舍内空气和舍外上风向(10m)、下风向(50m、100m、200m和500m)分离的须癣毛癣菌RFLP图谱有不同程度的相同。由此可见,须癣毛癣菌可从奶牛的病灶部位和粪便中散布到空气中,形成真菌气溶胶,并且随风向舍外传播,其传播的距离可达500m。这显示了动物体病原真菌能够形成气溶胶,借助舍内外气体交换,传播到牧场、舍外一定的距离。对波及到的社区居民形成感染风险。本研究的结论为:染色计数法更能客观的反映环境中气载微生物的含量,有助于对环境的健康风险做出科学地评估。而且,确定了皮肤病原真菌的气源性传播,为奶牛场的科学管理提供更准确的依据。

全文目录

符号说明  5-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-34
  1.1 微生物气溶胶的概述  13-20
    1.1.1 微生物气溶胶的概念及特性  13-15
      1.1.1.1 微生物气溶胶的概念  13
      1.1.1.2 微生物气溶胶的特性  13-15
    1.1.2 畜禽舍微生物气溶胶的成分  15-16
    1.1.3 微生物气溶胶造成的危害  16-18
      1.1.3.1 微生物气溶胶对畜牧业的危害  16-18
      1.1.3.2 微生物气溶胶对人类健康的危害  18
    1.1.4 真菌气溶胶  18-20
  1.2 真菌气溶胶的国内外研究进展及危害  20-23
    1.2.1 真菌溶胶的国内研究现状  20
    1.2.2 真菌气溶胶的国外研究现状  20-21
    1.2.3 真菌气溶胶的危害  21-23
  1.3 真菌气溶胶的检测  23-26
    1.3.1 沉降  23-24
    1.3.2 过滤  24
    1.3.3 冲击  24
    1.3.4 静电沉降  24-25
    1.3.5 离心和气旋  25
    1.3.6 撞击  25
    1.3.7 采样器的选择  25-26
    1.3.8 空气微生物采样发展趋势  26
  1.4 微生物气溶胶传播机制的研究  26-28
  1.5 奶牛皮肤真菌病及其病原  28-29
    1.5.1 奶牛皮肤真菌病  28
    1.5.2 奶牛皮肤真菌病病原  28-29
  1.6 分子生物学诊断方法  29-32
    1.6.1 DNA 碱基组成比例(G+C mol%)的测定  30
    1.6.2 序列分析  30
    1.6.3 实时荧光定量 PCR  30-31
    1.6.4 核酸杂交技术  31
    1.6.5 随机扩增多态性DNA(RAPD)分析  31-32
    1.6.6 限制性片段长度多态性(RFLP)分析  32
  1.7 本研究的目的及意义  32-34
2 材料与方法  34-41
  2.1 材料  34-37
    2.1.1 奶牛舍情况  34
    2.1.2 实验仪器  34-35
    2.1.3 培养基  35-36
    2.1.4 染色液  36
    2.1.5 主要试剂及用品  36
    2.1.6 主要工作液配制  36-37
  2.2 方法  37-41
    2.2.1 奶牛场情况  37
    2.2.2 样品的采集  37
    2.2.3 空气样品处理  37-38
    2.2.4 DNA 的提取及纯化  38-39
    2.2.5 PCR 扩增  39-40
    2.2.6 限制性片段长度多态性分析（RFLP）  40
    2.2.7 微生物气溶胶潜在危害的评估  40
    2.2.8 数据分析  40-41
3 结果与分析  41-48
  3.1 培养计数法测得的奶牛舍内微生物气溶胶的浓度  41
  3.2 DAPI 染色计数测得的奶牛舍内微生物气溶胶的浓度  41-42
  3.3 须癣毛癣菌的形态学鉴定结果  42-43
    3.3.1 菌落观察  42
    3.3.2 镜检结果  42-43
  3.4 DNA 的提取及 PCR 结果  43-44
    3.4.1 总DNA 的提取  43-44
    3.4.2 PCR 扩增结果  44
  3.5 IGS-RFLP 结果分析  44-47
  3.6 微生物气溶胶粒子的吸入量  47-48
4 讨论  48-51
  4.1 不同方法测定奶牛舍环境中微生物气溶胶浓度的比较  48-50
    4.1.1 DAPI 荧光染色计数与其他计数方法的比较  48
    4.1.2 培养方法和DAPI 染色方法的比较  48
    4.1.3 畜禽舍环境中微生物含量及其意义  48-49
    4.1.4 培养法计数的不足之处  49
    4.1.5 非可培养的微生物存在的潜在危害  49-50
  4.2 IGS-RFLP 对皮肤真菌气源性传播的研究  50-51
  4.3 奶牛舍内气载微生物吸入量的风险评估  51
5 结论  51-53
参考文献  53-61
附图  61-62
致谢  62-63
攻读学位期间发表论文及奖励  63-64
硕士学位论文内容简介及自评  64

染色法对奶牛舍气载微生物含量的检测及其真菌气溶胶传播的鉴定

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