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双向电泳与免疫印迹相结合筛选牛支原体免疫相关蛋白

作　者: 陈维
导　师: 张秀英
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 牛支原体双向电泳 Western blot 克隆与表达
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

牛支原体(M.bovis)是感染牛的一种重要致病性病原体,该病原在1961年从美国牛乳腺炎病例中首次分离,1976年美国首次报道牛支原体引起的肺炎。该病原除引起牛肺炎外,还可引发关节炎、乳腺炎、角膜结膜炎等疾病,这些与M.bovis相关的疾病被简称为MbAD。近几年MbAD已经在世界范围内广泛传播,在欧洲和北美更是大肆流行,给世界养牛业造成了很严重的经济损失。我国于2008年首次报道了M.bovis肺炎,继此在不同省份相继暴发了以犊牛呼吸道感染为主要临床特征的“传染性牛支原体肺炎”疫情。本研究在M.bovis湖北株的全基因组序列的测定完成的基础上,通过蛋白质组学技术初步分离鉴定M.bovis免疫相关分子,通过分子生物学方法初步验证其免疫功能,打破新型诊断试剂和疫苗研制的瓶颈,为M.bovis防治提供新的依据。首先,建立了分离M.bovis全菌蛋白的2-DE技术平台。通过对M.bovis全菌蛋白样品制备的方法,固相干胶条pH梯度上样量及染色等影响双向电泳图谱质量的关键因素与环节进行改进,成功提取了M.bovis的全细菌蛋白,并对M.bovis蛋白质组成分进行2-DE分离,建立了适合分离M.bovis蛋白的双向凝胶电泳技术方案,得到了分辨率较高和重复性较好的电泳图谱,为M.bovis蛋白质组学研究奠定了良好的基础。其次,成功地用菌体培养物攻毒制备的牛支原体阳性血清对M.bovis的全细菌蛋白进行了免疫蛋白质组学研究。利用M.bovis全细菌蛋白的2-D电泳凝胶Western blot结果在相应凝胶上找出具有免疫原性的蛋白质点,通过质谱分析并进行Mascot检索,得到了免疫相关蛋白的氨基酸序列,又通过序列比对从M.bovis湖北株基因库中获得免疫原性蛋白的编码序列。该方法的建立使得M.bovis免疫机制研究不再盲目,并为高通量、大规模地表达、纯化M.bovis免疫相关蛋白及其进一步的功能研究奠定了技术基础。本实验采用建立的方法筛选出了50个免疫原性蛋白,并在20个送测样品的质谱结果中获得了19个肽质量指纹图谱,其中12个蛋白在M.bovis湖北株基因库中找到了相应编码序列,这些蛋白经功能分析多数为酶类。最后,本实验针对优选出的氨基酸序列符合率最高的P32蛋白基因进行了基因的克隆,扩增的序列与参考序列100%同源。并顺利进行了表达和纯化,纯化后的重组蛋白用M.bovis湖北分离株培养物气管灌注攻毒后获得的阳性血清进行Western blot分析,结果为阳性,初步表明这个蛋白具有免疫性,用间接ELISA法对P32重组蛋白进行免疫学交叉反应实验,发现P32重组蛋白与自然感染和人工感染M.bovis阳性血清均能发生特异性反应,而与牛传染性胸膜肺炎(CBPP)及其他常见病原的阳性血清没有交叉反应,有希望用作鉴别诊断抗原。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-23
  1.1 牛支原体病概况  11-19
    1.1.1 牛支原体病病原学  11-13
    1.1.2 牛支原体病流行病学  13-14
    1.1.3 牛支原体病的诊断与防治  14-17
    1.1.4 牛支原体基因及蛋白质免疫学相关研究进展  17-19
  1.2 蛋白组学概述  19-22
    1.2.1 蛋白质组学的由来  19-20
    1.2.2 蛋白质组学常用技术  20-21
    1.2.3 蛋白质组学相关的生物信息学  21-22
  1.3 研究目的和意义  22-23
2 材料与方法  23-43
  2.1 实验材料  23-28
    2.1.1 菌株、质粒和宿主菌  23
    2.1.2 实验试剂  23
    2.1.3 实验设备  23-24
    2.1.4 实验中主要溶液及其配制  24-28
  2.2 方法  28-43
    2.2.1 牛支原体的培养  28
    2.2.2 菌体蛋白的制备  28-29
    2.2.3 蛋白浓度测定  29-30
    2.2.4 菌体蛋白双向电泳  30-33
    2.2.5 凝胶扫描及软件分析  33
    2.2.6 半干转印∕丽春红染色∕Western-blot 鉴定  33-34
    2.2.7 MALDI-TOF/ MS 鉴定蛋白  34-35
    2.2.8 基因水平验证免疫原性蛋白  35-38
    2.2.9 P32 蛋白的表达与纯化  38-42
    2.2.10 P32 重组蛋白的Western-blot 鉴定  42
    2.2.11 P32 重组蛋白的间接ELISA 实验  42-43
3 结果与分析  43-53
  3.1 牛支原体全菌蛋白样品的制备及浓度检测  43
  3.2 等电聚焦电泳不同上样量的电泳结果  43-45
  3.3 不同固定干胶条pH 范围的电泳结果  45
  3.4 不同染色方法的电泳结果  45-46
  3.5 M.bovis 蛋白2-DE 的重复性检测结果  46-47
  3.6 牛支原体全菌蛋白的 Western blot 检测图形比对结果  47
  3.7 部分蛋白点的质谱鉴定与数据库检索分析结果  47
  3.8 免疫相关蛋白 P32 的功能和编码基因分析结果  47-49
  3.9 免疫原性蛋白的验证  49-53
    3.9.1 p32 基因的克隆  49
    3.9.2 序列测定结果  49
    3.9.3 重组质粒 pET28a-P32 的鉴定结果  49-50
    3.9.4 p32 基因在大肠杆菌中的表达与纯化  50
    3.9.5 P32 重组蛋白的免疫活性检测  50-53
4 讨论  53-57
  4.1 牛支原体全菌蛋白双向凝胶电泳技术的建立  53-55
    4.1.1 蛋白样品的制备  53
    4.1.2 上样量及固相胶条pH 范围的选择  53-54
    4.1.3 染色方法的选择  54
    4.1.4 重复性检测  54
    4.1.5 目前双向电泳技术存在的不足之处  54-55
  4.2 2-DE 与Western blot 结合初筛牛支原体免疫原性蛋白  55-56
  4.3 免疫相关蛋白P32 的克隆、表达及免疫效果研究  56-57
5 结论  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-65
附录  65-67
攻读学位期间发表的学术论文  67

双向电泳与免疫印迹相结合筛选牛支原体免疫相关蛋白

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