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多粘类芽孢杆菌中抗菌物质的分离纯化及沙门氏菌毒性因子启动子库的构建与应用

作　者: 李江波
导　师: 段康民
学　校: 西北大学
专　业: 微生物学
关键词: 多粘类芽孢杆菌金黄色葡萄球菌沙门氏菌启动子库毒性因子抗生素
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

金黄色葡萄球菌是一种常见的病原菌,目前已对多种抗生素产生了抗药性。寻找新的抗金黄色葡萄球菌的物质,已成为医学和微生物学的一个重要课题。本实验室前期研究发现多粘类芽胞杆菌分泌物对金黄色葡萄球菌有抑制作用。多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是类芽孢杆菌属中的一种革兰氏阳性菌,由于其产生的多种次生代谢产物具有抑菌、防腐作用,近年在植物病虫害防治和抗生素分离研究方面受到了很大关注。本实验从多粘类芽孢杆菌J株培养物中,通过柱层析、高效液相等方法分离纯化出了一种活性物质,其对耐药性的金黄色葡萄球菌(MRSA)有明显的抑杀作用。再通过后续的质谱、核磁共振等实验确定出了该抑菌物质主要是两种分子量为414.5的非多肽类、容易相互转化的类似物。另一方面,在抗生素的后期分离纯化中,由于抗菌物质在溶液中含量低,对其抗菌活性跟踪极其困难。为了解决该问题,构建了一个沙门氏菌的毒性因子启动子-LuxCDABE报告子库。构建好的报告子菌株库,通过药物刺激其Lux发光情况的变化,可以用来检测低浓度的药物存在或者研究药物对启动子对应的毒性因子的影响。这种检测具有高灵敏、高通量、实时快速、重复性好的特点。研究挑选了沙门氏菌(Salmonella typhimurium LT2)的47个毒性因子,并扩展出了它们各自的启动子区域,将其连接到了一个质粒载体pCS26上,该质粒含有未带启动子的发光报告基因LuxCDABE。连接后的启动子-LuxCDABE报告子质粒,经多种方法验证后最终转回到了沙门氏菌中。构建好的启动子-LuxCDABE报告子可以用来检测浓度很低的多粘类芽孢杆菌抗性提取物：经柱层析纯化后的抗菌物稀释1000倍左右,对构建好的四株菌的发光有明显的减弱作用,但却不影响沙门氏菌的生长。由于多粘类芽孢杆菌抗性物质在高效液相单峰回收液中含量极低,常规的抑菌圈检测法很难满足需求,操作复杂。高灵敏度的启动子-LuxCDABE发光检测法可以很灵敏地检测出该物质的存在。此外,该毒性因子启动子库可以用来研究沙门氏菌的致病因子,而致病因子又是新的抗菌靶位。

全文目录

中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
图目录  10-11
表目录  11-12
缩略用语  12-13
第一章绪论  13-25
  1.1 多粘类芽孢杆菌中抗金黄色葡萄球菌物质  13-19
    1.1.1 研究背景  13
    1.1.2 多粘类芽孢杆菌简介  13-14
    1.1.3 国外多粘类芽孢杆菌的研究现状  14
    1.1.4 国内多粘类芽孢杆菌的研究现状  14-15
    1.1.5 金黄色葡萄球菌的耐药性  15
    1.1.6 金黄色葡萄球菌的治疗  15-17
    1.1.7 生物体中活性物质提取的常规方法  17-19
  1.2 沙门氏菌  19-22
    1.2.1 沙门氏菌的简介及研究现状  19-20
    1.2.2 沙门氏菌的毒性因子  20-21
    1.2.3 本实验所用沙门氏菌LT2研究情况  21-22
  1.3 基因表达启动子-报告子检测法  22-24
  1.4 本论文研究内容与意义  24-25
第二章实验材料  25-33
  2.1 实验材料  25-33
    2.1.1 菌株质粒  25
    2.1.2 培养基及常用试剂的配制  25-27
    2.1.3 试剂  27
    2.1.4 仪器  27
    2.1.5 扩增毒性因子启动子用到的PCR引物  27-33
第三章多粘类芽孢杆菌中抗性物质的分离纯化  33-46
  3.1 实验方法  33-37
    3.1.1 多粘类芽孢杆菌的固、液体规模培养  33
    3.1.2 样品的提取和浓缩  33-34
    3.1.3 受试菌的处理  34
    3.1.4 活性检测及多粘菌素(polymyxin)的排除  34-35
    3.1.5 浓缩粗提物CS柱层析分离纯化  35-36
    3.1.6 活性物质的理化处理  36
    3.1.7 抑菌谱检测  36
    3.1.8 活性物质作用方式的研究  36-37
    3.1.9 柱层析产物S1高效液相(HPLC)分离  37
    3.1.10 质谱与核磁分析  37
  3.2 实验结果  37-46
    3.2.1 固、液培养结果  37-38
    3.2.2 发酵活性粗提物与多粘菌素(polymyxin)的对照  38-39
    3.2.3 浓缩粗提物CS硅胶柱层析结果  39-40
    3.2.4 柱层析活性物质抑菌谱检测  40-41
    3.2.5 活性物质对金黄色葡萄球菌的作用方式  41
    3.2.6 活性物质的理化处理结果  41-42
    3.2.7 高效液相分析结果  42-43
    3.2.8 质谱分析结果  43-44
    3.2.9 核磁共振结果  44-46
第四章沙门氏菌毒性因子启动子库的构建与筛选  46-56
  4.1 实验方法  46-52
    4.1.1 质粒的小量提取  46-47
    4.1.2 沙门氏菌全基因组的提取  47
    4.1.3 PCR扩增启动子序列  47-48
    4.1.4 DNA片段的纯化回收  48
    4.1.5 DNA凝胶电泳  48
    4.1.6 感受态细胞的制备  48-49
    4.1.7 DNA的双酶切与连接  49
    4.1.8 电转化  49-50
    4.1.9 启动子库的具体构建方法  50-51
    4.1.10 多粘类芽孢杆菌提取物对启动子的筛选  51-52
  4.2 实验结果  52-56
    4.2.1 启动子序列的PCR扩增  52-53
    4.2.2 载体双酶切结果  53-54
    4.2.3 启动子库的构建情况  54
    4.2.4 多粘菌抗·性提取物筛选启动子库  54-56
第五章讨论  56-58
  5.1 抗性物质的分离纯化  56
  5.2 启动子库的构建及筛选  56-58
参考文献  58-66
致谢  66

多粘类芽孢杆菌中抗菌物质的分离纯化及沙门氏菌毒性因子启动子库的构建与应用

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