学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

新疆多浪羊IL-8的克隆、原核表达及棉酚对外周血淋巴细胞IL-8的表达的影响

作　者: 杨威华
导　师: 陶大勇；李莲瑞
学　校: 塔里木大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 多浪羊白细胞介素8 棉酚 IL-8 原核表达
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 35次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

新疆是畜牧大省,也是棉花种植大省,每年大量的棉副产品如棉籽饼和棉子壳饲喂家畜,时有家畜棉酚中毒发生。慢性棉酚中毒的牛羊等家畜的血液中嗜中性粒细胞发生显著增多,中毒牛羊的许多组织和器官发生炎症损伤,而IL-8对嗜中性粒细胞具有极其显著的趋化和激活效应,嗜中性粒细胞活化后能诱发严重的炎症反应和器官和组织损伤,所以本研究拟从IL-8的表达角度探讨嗜中性粒细胞显著增多与棉酚中毒绵羊的组织和器官炎症的关系。1.本实验参考NCBI绵羊的IL-8序列NM₀01 009 401.1设计多浪羊的IL-8引物,提取外周血淋巴细胞的总RNA,应用RT-PCR克隆和测序了多浪羊的IL-8编码序列,序列分析发现测序序列中有一个SNP,通过联合应用IL-8的核苷酸多序列比对和mRNA二级结构预测,分析发现该SNP会影响IL-8 mRNA编码的二级结构,并会导致IL-8蛋白的翻译效率提升。2.实验使用0、5、10、20、40μmol/L的棉酚浓度分别以12小时和24小时刺激培养外周血淋巴细胞,提取总RNA,应用RT-PCR方法,以GAPDH的表达量为参照,检测IL-8的表达变化。发现外周血淋巴细胞IL-8的表达量随棉酚浓度和细胞培养的时间呈有规律的变化。该实验显示IL-8可能在绵羊棉酚中毒的早期炎症引发中起先导作用。3.在构建IL-8克隆载体的基础上,利用pET-28b质粒应用DNA重组技术构建IL-8的原核表达载体,并进行了IL-8的蛋白表达,为进一步从蛋白层面研究IL-8在绵羊棉酚中毒中的作用奠定了基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章综述  10-21
  1.1 棉酚的物理和化学性质  10
  1.2 棉酚的医药作用和毒理学作用  10-11
  1.3 绵羊棉酚中毒的症状  11-12
  1.4 棉酚中毒家畜的血细胞变化  12
  1.5 新疆地区棉副产品的棉酚含量  12-13
  1.6 新疆地区棉酚产品用作动物饲料的情况  13-14
  1.7 绵羊棉酚中毒实验  14-17
  1.8 绵羊棉酚中毒机理的研究  17-18
  1.9 IL-8 对嗜中性粒细胞的趋化和激活作用  18
  1.10 IL-8 的 MRNA 转录激活机制  18-19
  1.11 棉酚刺激体外培养白细胞的浓度  19-20
  1.12 本课题研究的目的和意义  20-21
第二章多浪羊 IL-8 的克隆、测序和序列分析  21-36
  2.1 材料  21-22
    2.1.1 实验动物  21
    2.1.2 实验仪器  21
    2.1.3 实验试剂  21-22
    2.1.4 菌株和载体  22
    2.1.5 主要溶液配制  22
  2.2 方法  22-26
    2.2.1 采集多浪羊的静脉血  22
    2.2.2 分离 PBMC  22
    2.2.3 设计和合成绵羊 IL-8 的引物  22-23
    2.2.4 提取总 RNA 及质量检测  23
      2.2.4.1 总 RNA 的提取步骤  23
      2.2.4.2 电泳检测总 RNA  23
    2.2.5 总 RNA 逆转录成cDNA  23-24
    2.2.6 PCR 扩增 IL-8  24
    2.2.7 目的条带的切胶回收  24
    2.2.8 克隆载体的构建和转导 E.coli DH 5α菌株  24
    2.2.9 菌液 PCR 鉴定  24-25
    2.2.10 质粒的提取和双酶切鉴定  25
    2.2.11 送测序  25
    2.2.12 测序序列分析  25-26
  2.3 结果  26-33
    2.3.1 总 RNA 提取的电泳图像  26
    2.3.2 IL-8 的 RT-PCR 结果  26
    2.3.3 pMD-18T-IL-8 菌液 PCR 和双酶切鉴定结果  26-27
    2.3.4 IL-8 的测序结果  27
    2.3.5 IL-8 的序列分析结果  27-33
  2.4 分析和讨论  33-35
    2.4.1 IL-8 的克隆和测序  33
    2.4.2 测序序列的初步分析  33
    2.4.3 进化树引导的IL-8 的核苷酸多序列比对分析  33-34
    2.4.4 EST 数据库序列比对分析和验证  34-35
    2.4.5 测序序列的二级结构预测和分析  35
  2.5 小结  35-36
第三章棉酚对体外培养的 PBMC 的IL-8 表达的影响  36-47
  3.1 材料  36-37
    3.1.1 实验动物  36
    3.1.2 实验仪器  36
    3.1.3 实验试剂  36
    3.1.4 主要溶液配制  36-37
  3.2 方法  37-38
    3.2.1 采集多浪羊的静脉血  37
    3.2.2 分离PBMC  37
    3.2.3 外周血淋巴细胞的培养  37
    3.2.4 提取总RNA  37
    3.2.5 总 RNA 逆转录成cDNA  37
    3.2.6 内参GAPDH 的引物设计  37-38
    3.2.7 半定量 PCR 检测 IL-8 的表达量  38
    3.2.8 IL-8 表达的凝胶定量化分析  38
    3.2.9 IL-8 表达量的Spss 统计分析  38
  3.3 结果  38-43
    3.3.1 IL-8 表达的RT-PCR 检测结果  38-39
    3.3.2 IL-8 表达的凝胶定量分析结果  39-40
    3.3.3 IL-8 表达量的Spss 统计分析结果  40-43
  3.4 分析和讨论  43-46
    3.4.1 棉酚刺激下多浪羊外周血淋巴细胞的IL-8 表达变化  43
    3.4.2 棉酚刺激下外周血淋巴细胞的 IL-8 表达变化的可信度  43-44
    3.4.3 棉酚刺激下外周血淋巴细胞的 IL-8 表达升高的分子机理  44-45
    3.4.4 高浓度棉酚和长时间培养下外周血淋巴细胞的IL-8 表达降低的原因  45-46
    3.4.5 IL-8 表达升高在绵羊棉酚中毒中的意义  46
    3.4.6 IL-8 的SNP 在绵羊棉酚中毒中的意义  46
  3.5 小结  46-47
第四章 IL-8 原核表达载体的构建和蛋白表达  47-53
  4.1 材料  47-48
    4.1.1 实验仪器  47
    4.1.2 菌株和载体  47
    4.1.3 溶液配制  47-48
  4.2 方法  48-50
    4.2.1 IL-8 克隆菌株E.coli DH5α的活化和培养  48
    4.2.2 pMD-18T-IL-8 克隆载体pMD-18T 的提取、酶切、电泳及目的条带的回收  48
    4.2.3 pET-28b 质粒酶切、电泳及目的条带的回收  48-49
    4.2.4 IL-8 原核表达载体的构建和转化表达菌株E.coli BL_(21)1(DE3)  49
    4.2.5 转导的表达菌株E.coli BL_(21)(DE3)的培养和IPTG 刺激 IL-8 蛋白的表达  49-50
    4.2.6 IL-8 融合蛋白的提取和处理  50
    4.2.7 IL-8 融合蛋白的电泳  50
  4.3 结果  50-51
    4.3.1 IL-8 克隆载体pMD-18T 和pET-28b 质粒的酶切电泳图  50-51
    4.3.2 IL-8 融合蛋白电泳结果  51
  4.4 分析和讨论  51-52
    4.4.1 IL-8 原核表达载体的构建  51-52
    4.4.2 影响融合蛋白表达的因素  52
  4.5 小结  52-53
结论  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-58

新疆多浪羊IL-8的克隆、原核表达及棉酚对外周血淋巴细胞IL-8的表达的影响

内容摘要

全文目录

相似论文