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TteRRF，AmCBL1初步晶体学和嗜热菌ATCC27502-ATP合酶晶体生长研究

作　者: 尚桂军
导　师: 仓怀兴；张文杰；高伟
学　校: 北京林业大学
专　业: 生物物理
关键词: 腾冲嗜热菌 核糖体循环因子 FOFI-ATPasc 沙冬青 钙调神经磷酸酶B样蛋白I(CBLI) CBL相互作用蛋白激酶
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 34次
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内容摘要


核糖体循环因子(RRF)是一种催化蛋白质合成全过程(起始,延伸,终止和翻译后复合体)中翻译后复合体的解体的蛋白。由于腾冲嗜热菌RRF (TteRRF) C-端的截短体和一些嗜温菌RRF在非允许温度下拯救大肠杆菌温度敏感突变体(frrts)表现出不同的特性,为了从分子结构上阐明这些现象,就需要对这些分子的精细结构有更明确的认识。将TteRRF构建入原核表达载体pET-DB,经过Ni亲和层析,离子交换层析,和分子筛层析纯化后经化学修饰,用于晶体生长并得到了用于衍射的单晶,衍射数据经过处理后衍射分辨率为2.8A,空间群为P6122/P6522,晶胞参数为a=103.264A,b=103.264A,c=89.173A,α=90.000,β=90.000,γ=120.000。ATP合成酶(FOF1-ATPase)是一个广泛存在各种生物膜上的马达蛋白,它在质子电化学梯度驱动下合成ATP,又可以利用ATP驱动质子的跨膜运输。它是一个跨膜的超分子复合体,原核生物的ATP合成酶有水溶性部分F1和跨膜的F0两部分组成,F1包括α3β3γδε, F0包括ab2cn。目前大部分的亚基结构已经解析,只有a亚基和b亚基的C端没有高分辨率的结构,另外整个全酶这个膜蛋白复合物没有完整的结构报道。本文选用了极端嗜热菌ATCC27502 F0F1-ATPase作为研究对象,天然提取了完整的F0F1-ATPase, SDS-PAGE显示纯度为70%以上,有高水解ATP活性,动态光散射检测为比较均匀的单体,用悬滴法筛选晶体,得到了微晶,为晶体进一步优化提够了基础。钙调神经磷酸酶B样蛋白1(CBL1)是一种植物钙信号的传导器,它把钙信号传递给他的下游分子,CBL相互作用蛋白激酶23(CBL interaction protein kinase23, CIPK23)。CBL1和CIPK23信号转导途径,在植物应答逆境环境(例如,低钾,渗透压,盐胁迫,冷冻和干旱)中起了重要作用。将截短的沙冬青CBL1 (AmCBL1Δ17)野生型基因及其突变基因构建入pET-22b(+)载体,转化入BL21 (DE3)过表达,经过Ni柱亲和层析,DEAE离子交换层析和分子筛层析纯化后筛选晶体,其中突变体AmCBL1Δ17-123衍射能力最好,收到一套2.9A的衍射数据,数据经过处理,该晶体的空间群为P21212,晶胞参数为a=99.87 A,b=114.42 A,c=63.80A,α=β=γ=90.00。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
目录  6-9
引言  9-16
  1 结构生物学简介  9-10
  2 X-射线晶体学  10-14
    2.1 X射线晶体学的简要背景  10-11
    2.2 蛋白质结晶  11-12
    2.3 蛋白质分子溶液分散性及晶体生长难易检测手段之一—动态光散射  12-14
    2.4 晶体优化方法之一-接种(seeding)  14
  3 本文研究目的和意义  14-16
第一章 腾冲嗜热菌核糖体循环因子(TteRRF)初步晶体学研究  16-40
  1.1 核糖体再循环因子(RRF)简介  16
  1.2 RRF的研究历史  16-17
  1.3 RRF的功能  17-18
  1.4 RRF分子作用机理  18-21
    1.4.1 RRF催化翻译后复合物解体的反应过程  18-19
    1.4.2 具体分子机制-tRNA-mimic和反tRNA-mimic模型  19-20
    1.4.3 其他物种RRF三维结构  20-21
    1.4.4 腾冲嗜热菌简介和其RRF作为模型功能研究介绍  21
  1.5 材料  21-22
  1.6 主要仪器  22
  1.7 pET-DBTteRRF表达载体的构建  22-27
    1.7.1 pET-DB载体  22-23
    1.7.2 PE-TDBTteRRF表达载体的构建  23-27
  1.8 重组蛋白的纯化  27-29
  1.9 RRF蛋白分子的甲基化处理  29-30
  1.10 纯化后RRF检测  30-32
    1.10.1 测定蛋白浓度  30
    1.10.2 利用动态光测溶液中蛋白聚合状态的均匀性  30-31
    1.10.3 利用SDS-PAGE检测RRF蛋白纯度  31-32
  1.11 RRF晶体筛选和生长  32-34
    1.11.1 野生型RRF晶体筛选  32
    1.11.2 甲基化RRF晶体筛选  32-34
  1.12 RRF晶体衍射  34-38
    1.12.1 防冻液的选用  34-35
    1.12.2 数据收集和处理  35-38
  1.13 讨论  38-40
第二章 极端嗜热菌ATCC-27502 ATP合成酶全酶(FOF1-ATPase)的提取,纯化和结晶  40-53
  2.1 ATP合酶的亚基组成和结构  40-42
    2.1.1 ATP合酶的亚基组成  40-42
  2.2 ATP合酶结构  42-45
    2.2.1 ATP合酶的整体结构  42-43
    2.2.2 ATP合酶的各亚基结构研究概况  43-45
  2.3 ATP合酶旋转催化机理  45-46
  2.4 膜蛋白晶体生长  46-47
  2.5 极端嗜热菌ATCC27502特征及研究意义  47
  2.6 材料  47
  2.7 仪器  47-48
  2.8 细菌培养,收集,重悬,破碎,提膜  48
  2.9 膜蛋白抽提  48
  2.10 膜蛋白纯化  48-51
  2.11 FoF1-ATPase结晶条件的筛选  51-52
  2.12 讨论  52-53
第三章 沙冬青钙调神经磷酸酶B样蛋白1(AmCBL1)的初步晶体学研究  53-71
  3.1 植物体内的钙信号传递元件  53
  3.2 CBL/CIPK信号系统的生物学功能  53-54
  3.3 CBL及CBL-CIPK complex结构研究进展  54
  3.4 CBL1研究意义  54-55
  3.5 实验材料  55
  3.6 表达载体的构建  55-60
  3.7 突变体构建  60-61
  3.8 基因诱导表达  61-62
  3.9 AmCBL1蛋白纯化和检测  62-65
  3.10 晶体筛选  65-66
  3.11 突变体晶体的生长  66-68
  3.12 晶体衍射  68-70
  3.13 讨论  70-71
结论  71-72
参考文献  72-81
个人简介  81-82
导师简介  82-83
致谢  83

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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