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华南地区口蹄疫流行毒株VP1基因核苷酸序列分析及FMDV衣壳蛋白前体P1在FCV中的表达

作　者: 谢守玉
导　师: 陆芹章；吴健敏
学　校: 广西大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒衣壳蛋自 FCV 嵌合病毒
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

口蹄疫(Foot and mouth disease)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus)引发的感染猪、牛和羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性人兽共患疾病。其易感动物种类多、传播速度快、流行范围广、难以防治,严重降低家畜生产性能并影响国际间动物及畜产品的贸易。目前,国内主要采取疫苗免疫进行防制。本研究将获得的2010年广东口蹄疫毒株O-ST-2010的衣壳蛋白VP1核苷酸序列同往年华南地区的流行株及参考株的VP1核苷酸序列进行比对分析,并建立遗传进化树。结果显示,O-ST-2010毒株同我国分离株O/HLJOC12/03相似性最高,为93.8%；与东南亚型各参考毒株的相似性在92.2%-83.3%之间,而与其他基因型的毒株的相似性均在85%以下。且同往年华南地区的流行株,在拓扑型上分类并不属于同一谱系。往年华南地区的流行株为新猪毒系或泛亚系毒株(属于古典中国型或中东-南亚型),而O-ST-2010毒株为云南耿马系(属于东南亚型)。当前我国使用的疫苗株均为古典中国型或中东-南亚型,尚无针对东南亚型毒株的疫苗。流行毒株基因型的改变,意味着病毒抗原型的改变。导致华南地区当前使用的疫苗保护力降低,使得华南地区口蹄疫的防控而临严峻的形势,尽快研制出针对东南亚型毒株的疫苗迫在眉睫。为了评估FCV作为基因工程载体的可行性,开辟FMD重组活载体疫苗新的途径,本研究将FMDV衣壳蛋白前体P1插入到猫杯状病毒(Feline Calicivirus, FCV)感染性克隆载体中,构建成重组的FCV。FCV是单股正链RNA病毒,基因组大小约为7.8kb,属于杯状病毒科囊病毒属的成员,是猫科动物中广泛流行的高度接触传染性的重要病原体。为了验证FCV 3C样蛋白酶识别基序是否为8个氨基酸,将FMDVP1内部的蛋白酶切位点突变为FCV 3C样蛋白酶的识别基序,即蛋白酶切位点处的N端和C端各4个氨基酸共8个氨基酸序列。将突变后的P1基因即P1M2分别插入到FCV感染性克隆载体的前导蛋白LC中及LC后的位点,构建成重组病毒载体rmFCV-LC-P1M2和rmFCV-EA-P1M2,并转染F81细胞。通过间接免疫荧光、RT-PCR、SDS-PAGE及Western-blot验证FMDV P1基因在FCV中的表达,并比较重组FCV同亲本FCV的复制生长动力学。结果显示,两个嵌合体病毒皆能引起细胞病变；间接免疫荧光检测转染细胞有荧光产生；转染细胞培养产物RT-PCR鉴定有大小约2232bp的目的片段；SDS-PAGE电泳结果显示有大小分别为83kD和63kD的目的条带,与设计的FMDV P1蛋白及FCV衣壳蛋白大小正好相符,表明所设计的3C样蛋白酶能够对P1M2进行酶切修饰,使FCV重组病毒表达独立的结构蛋白,识别基序起到预期的作用；Western-blot检测结果显示重组毒表达的83kD的目的蛋白具有反应原性；重组病毒rmFCV-EA-P1M2同亲本毒的生长曲线基本一致,而rmFCV-LC-P1M2的生长水平(TCID50)则相对较低。上述结果证实FMDVP1在FCV中成功获得表达,表明FCV作为表达外源基因的基因工程载体应用前景良好,同时,也为研发口蹄疫重组活载体疫苗开辟新的途径。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
常用缩写词  9-12
第一部分: 文献综述  12-31
  第一章口蹄疫疫苗研究进展  12-22
    1 口蹄疫的基本概况  12-14
    2 口蹄疫疫苗研究进展  14-22
      2.1 灭活疫苗  14-15
      2.2 合成肽疫苗  15-16
      2.3 核酸疫苗  16-18
      2.4 空衣壳疫苗  18-20
      2.5 重组活载体疫苗  20-22
  第二章猫杯状病毒表达系统的研究进展  22-31
    1 猫杯状病毒的基本特征  22
    2 FCV基因组结构及其编码的产物  22-26
    3 FCV的致病性及致病机理  26-28
    4 疫病的流行病学特征  28-29
    5 FCV反向遗传学研究进展  29-31
第二部分华南地区口蹄疫流行毒株VP1基因核苷酸序列分析  31-38
  1 材料与方法  31
  2 结果与分析  31-36
  3 讨论  36-38
第三部分实验内容  38-74
  实验技术路线  38-39
  研究一表达FMDV衣壳蛋白前体P1重组FCV载体的构建  39-61
    1 材料  39-41
    2 方法与步骤  41-54
    3 结果与分析  54-60
    4 结论  60-61
  研究二 FMDV衣壳蛋白前体P1在FCV中的表达  61-74
    1 材料  61
    2 方法与步骤  61-67
    3 结果与分析  67-71
    4 讨论  71-74
全文总结  74-75
参考文献  75-85
致谢  85-86
攻读学位期间发表的论文情况  86

华南地区口蹄疫流行毒株VP1基因核苷酸序列分析及FMDV衣壳蛋白前体P1在FCV中的表达

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