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羊口蹄疫病毒Asia 1型多表位疫苗的研制

作　者: 王景锋
导　师: 常惠芸
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒表位疫苗绵羊IgG重链恒定区 3D蛋白
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus)所引起的严重威胁世界畜牧业发展和国际进出口贸易的烈性传染病。人们在与FMD长期的斗争过程中已经充分认识到,应用疫苗进行免疫接种是预防、控制乃至消灭FMD的有效手段之一。尽管目前有传统的灭活疫苗可资利用,但口蹄疫依然严重困扰着全世界无数动物的卫生健康及世界动物及其产品贸易,这在一定程度上与当前所用灭活疫苗的缺陷有关。所以研制更为安全有效的新型疫苗已经迫在眉睫,而表位疫苗是目前FMDV基因工程疫苗中具有良好开发和应用前景的重要疫苗形态。VP1蛋白是FMDV诱导机体产生抗病毒感染免疫的主要蛋白,含有病毒的若干中和表位。本研究在成功克隆Asia 1型FMDV VP1蛋白编码基因,并对其序列进行全面分析的基础上,设计和合成了由136~160aa和198~211aa两个表位组成的重复串联表位的编码基因,并克隆了羊IgG重链恒定区编码基因。利用BamH I、EcoR I和Xho I位点将2个基因片段依次克隆到pPROExHTb载体,构建成重组质粒pPRO-FshIgG,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达得到融合蛋白FshIgG。同时克隆了FMDV非结构蛋白3D并实现了其在大肠杆菌中的成功表达,而且发现3D蛋白以可溶性和变性的两种状态表达于菌体内。100μg FshIgG蛋白单独或其与变性状态的3D蛋白组合免疫豚鼠后刺激豚鼠产生了高效价的FMDV中和抗体,其抗体水平基本达到了商品化灭活疫苗的水平,而且使免疫豚鼠在用200 ID50剂量FMDV攻击时得到了完全保护。FshIgG与以可溶性状态存在的3D蛋白组合构成的疫苗免疫豚鼠所产生的中和抗体水平明显低于上述两组动物。进一步的淋巴细胞增殖实验表明,可溶性的3D蛋白与FshIgG蛋白共免疫时在一定程度上抑制了机体淋巴细胞的增殖能力,从而降低了免疫效果,使免疫动物不能得到有效的保护。当用由100μg FshIgG蛋白制备的疫苗和由100μg FshIgG和100μg变性的3D蛋白组成的抗原制备的疫苗免疫绵羊时,绵羊都产生了较高滴度的抗FMDV抗体,而且后者免疫绵羊的抗体水平明显高于前者。理论推测认为,当绵羊体内存在如此滴度的抗体水平时,在自然感染条件下,这些动物能够得到完全保护。由此证明,羊IgG重链恒定区蛋白能够作为FMDV表位肽的载体,而融合蛋白FshIgG可成为一种口蹄疫表位疫苗候选物用于口蹄疫的预防,FshIgG与变性的FMDV 3D蛋白的组合是较好的疫苗配伍方式。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-13
第一章前言  13-26
  1.1 研究的目的和意义  13
  1.2 国内外研究现状  13-25
    1.2.1 口蹄疫和口蹄疫病毒  13-14
    1.2.2 口蹄疫病毒疫苗研究概况  14-19
    1.2.3 口蹄疫病毒表位疫苗研究进展  19-25
  1.3 研究内容和方法  25-26
第二章羊IgG 重链恒定区基因、Asia I 型口蹄疫病毒VP1 和3D 基因的克隆  26-37
  2.1 实验材料  26-28
    2.1.1 病毒、组织材料、载体及菌株  26
    2.1.2 酶和主要试剂  26
    2.1.3 实验所用溶液及其配制  26-28
    2.1.4 仪器  28
  2.2 实验方法  28-32
    2.2.1 引物设计与合成  28-29
    2.2.2 RNA 的提取  29
    2.2.3 RT-PCR  29-30
    2.2.4 PCR 产物的回收与纯化  30
    2.2.5 目的基因的克隆  30-31
    2.2.6 重组质粒的鉴定  31-32
  2.3 实验结果  32-36
    2.3.1 基因扩增  32
    2.3.2 基因克隆  32-33
    2.3.3 基因序列测定  33-36
  2.4 讨论  36-37
第三章 Asia I 型口蹄疫病毒中和表位与羊IgG 重链恒定区的融合蛋白和3D 蛋白的原核表达  37-58
  3.1 试验材料  37-43
    3.1.1 感受态细胞和原核表达载体  37
    3.1.2 酶和主要试剂  37
    3.1.3 实验所用溶液及其配制  37-43
    3.1.4 实验仪器  43
  3.2 实验方法  43-50
    3.2.1 FMDV 抗原表位编码基因的合成  43
    3.2.2 引物设计合成  43
    3.2.3 原核表达重组质粒的构建  43-47
    3.2.4 重组质粒的诱导表达  47-48
    3.2.5 表达蛋白质的纯化  48-50
    3.2.6 表达蛋白的Western blotting 分析  50
  3.3 实验结果  50-56
    3.3.1 FMDV 抗原表位基因的设计、化学合成  50-51
    3.3.2 表位基因片段获得和表达用引物 PCR 扩增产物  51
    3.3.3 重组表达质粒的鉴定  51-52
    3.3.4 蛋白表达、可溶性分析与纯化  52
    3.3.5 表达蛋白的Western blotting 分析  52-56
  3.4 讨论  56-58
第四章绵羊 IgG 重链恒定区蛋白携带 Asia 1 型 FMDV 中和表位融合蛋白免疫原性的测定  58-69
  4.1 实验材料  58
    4.1.1 病毒、细胞和实验动物  58
    4.1.2 主要试剂  58
  4.2 实验方法  58-62
    4.2.1 抗原制备  58-59
    4.2.2 动物免疫  59
    4.2.3 血清抗体动态监测  59-60
    4.2.4 中和抗体效价测定  60
    4.2.5 动物保护性试验  60-61
    4.2.6 免疫效果的细胞水平检测  61-62
    4.2.7 绵羊免疫效果监测  62
  4.3 实验结果  62-67
    4.3.1 豚鼠血清抗体的测定  62-63
    4.3.2 豚鼠血清中和抗体效价的测定  63-64
    4.3.3 豚鼠攻毒试验  64-65
    4.3.4 淋巴细胞增殖能力  65
    4.3.5 疫苗免疫绵羊的抗体效价检测  65-67
  4.4 讨论  67-69
第五章全文结论  69-70
参考文献  70-75
致谢  75-77
附录  77-79
作者简历  79

羊口蹄疫病毒Asia 1型多表位疫苗的研制

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