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环氧化物水解酶产生菌的筛选及其发酵条件和对苯基缩水甘油醚类化合物拆分条件的研究

作　者: 盛艳旻
导　师: 朱勍；王宇光
学　校: 浙江工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: Botryosphaeria dothidea ZJUZQ007 环氧化物水解酶手性拆分发酵
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

手性环氧化物及其水解产物邻二醇是合成许多生物活性物质和手性目标产物的高价值中间体。本实验以邻甲氧基苯基缩水甘油醚为唯一碳源进行多轮富集,从土壤中获得380多株能利用该环氧化物的微生物。之后用TLC法定性筛选出25株具有环氧化物水解酶活性的菌株,之后再通过HPLC法筛选出5株具有立体选择性的菌株,从中选取最好的一个菌株进行下一步研究并进行菌株鉴定,经过形态观察及ITS基因序列分析,确定该菌株为Botryosphaeria dothidea,编号为ZJUZQ007。以单因素方法,对发酵培养基的配方及发酵条件进行了优化,考察了不同的碳源、氮源、金属离子及浓度、发酵培养基初始pH值、菌体培养温度以及底物诱导对菌株的生长及酶活的影响。最终确立了菌株Botryosphaeria d.ZJUZQ007的最优发酵培养基配方:以2%乳糖为碳源,2%玉米粉为氮源,金属离子为2mmol/L的Fe2+,1%的NaCl,最适培养条件为30℃,最适pH在4.0-7.0之间,发酵时间为72h,该酶为非诱导型酶,无需加入底物做诱导剂。对Botryosphaeria d.环氧化物水解酶拆分邻甲氧基苯醚(EMPP)、邻甲基苯醚(o-GMPE)、间甲基苯醚(m-GMPE)、对甲基苯醚(p-GMPE)四种环氧化物的反应条件进行了优化。确定了最佳反应温度为30℃,最适缓冲液pH为7.6及最适反应时间为40min,在此反应条件下,(R)-EMPP的e.e.s和E值分别达到了99.9%和50.4,(R)-o-GMPE则为99.9%和48.6,而(R)-m-GMPE是91.2%和18.1,(S)-p-GMPE则是98.0%和29.5。同时发现,该菌株环氧化物水解酶对底物的选择性及活性受底物苯环上取代基的类型及取代基位置的影响。用分子模拟对接软件(Discovery Studio 2.1),通过模拟酶与底物的结合情况对这个实验结果成功地进行了解释。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
符号说明  11-12
第一章前言  12-25
  1.1 环氧化物及环氧化物水解酶简介  12-15
    1.1.1 环氧化物简介  12-13
    1.1.2 环氧化物水解酶简介  13-15
  1.2 EH的催化机制  15-17
  1.3 手性环氧化物的制备  17-20
    1.3.1 手性环氧化物的化学法合成  18-19
    1.3.2 手性环氧化物的生物合成法  19-20
  1.4 环氧化物水解酶(EH)对环氧化物的动力学拆分  20-25
    1.4.1 来自细菌环氧化物水解酶的研究  22
    1.4.2 来自真菌环氧化物水解酶的研究  22-23
    1.4.3 微生物环氧化物水解酶的研究进展  23-25
  1.5 本课题的研究目的及内容  25
第二章环氧化物水解酶产生菌的筛选  25-36
  2.1 实验材料与方法  26-31
    2.1.1 主要仪器  27
    2.1.2 主要试剂  27-28
    2.1.3 菌株来源  28
    2.1.4 e.e.值和底物E值的计算  28-29
    2.1.5 培养基  29
    2.1.6 试剂的配制  29
    2.1.7 底物的化学合成  29-30
    2.1.8 底物的化学法水解  30
    2.1.9 菌种的筛选与分离  30-31
    2.1.10 微生物菌种鉴定  31
      2.1.10.1 菌落形态观察  31
      2.1.10.2 ITS基因序列测序分析  31
  2.2 结果与讨论  31-34
    2.2.1 筛选结果  31-33
    2.2.2 菌种的纯化与鉴定  33-34
      2.2.2.1 菌落形态观察  33
      2.2.2.2 ITS基因序列测序分析  33-34
  2.3 本章小结  34-36
第三章Botryosphaeria dothideaZJUZQ007 发酵条件的优化  36-46
  3.1 实验材料和方法  36-38
    3.1.1 主要仪器  36
    3.1.2 试剂  36-37
    3.1.3 菌种  37
    3.1.4 培养基  37
    3.1.5 Botryosphaeria d.ZJUZQ007 菌体制备及整细胞转化  37
    3.1.6 生物量测定  37
    3.1.7 酶活力单位定义  37-38
  3.2 实验结果与讨论  38-44
    3.2.1 碳源对菌体酶活和生物量的影响  38-39
    3.2.2 氮源对菌体酶活和生物量的影响  39-40
    3.2.3 金属离子对菌体酶活和生物量的影响  40-41
    3.2.4 Fe~(2+)离子浓度对菌体酶活和生物量的影响  41-42
    3.2.5 温度对菌体酶活和生物量的影响  42-43
    3.2.6 初始pH对菌体酶活和生物量的影响  43-44
    3.2.7 底物诱导对菌体酶活和生物量的影响  44
  3.3 本章小结  44-46
第四章 Botryosphaeria d.ZJUZQ007 整细胞对环氧化物拆分条件的初探  46-56
  4.1 实验材料与方法  46-49
    4.1.1 主要实验仪器  46-47
    4.1.2 主要实验试剂  47
    4.1.3 菌株  47
    4.1.4 培养基  47
    4.1.5 菌体的制备  47-48
    4.1.6 GMPE的化学合成  48
    4.1.7 GMPE的化学法水解  48
    4.1.8 静态细胞转化实验  48-49
  4.2 结果与讨论  49-54
    4.2.1 反应温度对拆分效果的影响  49-50
    4.2.2 反应体系的pH对拆分效果的影响  50-51
    4.2.3 反应时间对拆分效果的影响  51-52
    4.2.4 底物苯环上取代基对EH选择性的影响  52-54
  4.3 本章小结  54-56
第五章总结与展望  56-59
  5.1 实验总结  56-57
  5.2 展望  57-59
参考文献  59-64
附图1  64-65
附图2  65-66
附图3  66-67
致谢  67-68
攻读硕士学位期间发表的学术论文  68

环氧化物水解酶产生菌的筛选及其发酵条件和对苯基缩水甘油醚类化合物拆分条件的研究

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