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Cry1Ac蛋白ELISA检测体系的建立

作　者: 倪庚
导　师: 余挺
学　校: 浙江大学
专　业: 食品科学
关键词: 转基因食品 Cry1Ac蛋白 兔单克隆抗体 兔多克隆抗体 ELISA 样品检测
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


Bt基因是目前转基因食品中使用最广泛且最有效的一种杀虫基因,并且被广泛应用于基因工程中。目前所发现的Bt基因有130多种,而且新的Bt基因还在不断的被发现和鉴定。Bt基因主要包括晶体蛋白家族基因(Cry)和细胞溶解蛋白基因(Cyt)。在进行转基因食品研究、开发和商业化的同时,建立恰当的方法对转基因食品中转基因成分进行快速鉴定与检测,能够促进农业转基因生物安全管理,保障人和动物以及微生物的安全,同时能够保护生态环境,促进农业转基因生物技术的进一步研究。本文以目前研究最多的抗虫Cry1Ac基因表达的Cry1Ac蛋白为检测目标,在提取获得高纯度抗原后制备高度特异性的多克隆抗体、单克隆抗体和HRP酶标抗体的基础上,比较了三种ELISA方法的灵敏度和线性检测范围,初步建立起了能够快速检测Cry1Ac蛋白的ELISA检测试剂盒。主要试验结果如下：1. CrylAc蛋白纯度和浓度分析通过SDS-PAGE对抗原蛋白Cry1Ac的纯度分析结果表明,所获得的抗原蛋白纯度高,分子量在66.4KDa左右,达到了免疫所需要的纯度与分子量标准；采用BCA试剂盒测定蛋白浓度的结果表明,Cry1Ac蛋白浓度为1.31mg/mL,达到了免疫所需的抗原浓度要求。2.多抗血清纯化及多克隆抗体制备将Cry1Ac蛋白与等量弗氏完全佐剂混合后采用背部皮下多点注射(免疫两只兔子编号3359、3360),四次免疫后,3360号兔子血清效价高于10000,说明3360号兔子血清对免疫抗原具有良好的亲和性,且其免疫效果明显较3359号兔子好,因此对3360号兔子在进行加强免疫之后取全血、并通过Sepharose CL-4B Protein A柱对该兔子的多抗进行分离纯化。利用SDS-PAGE技术对纯化后的多克隆抗体进行纯度分析的结果表明,分离纯化后的多克隆抗体具有极高纯度(>90%),几乎没有其他杂蛋白。3.杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备进一步通过免疫三只兔子(编号82、83、84)制备兔单克隆抗体的结果表明：所选择的编号为84号的免疫效果最好。取该编号兔的脾融合17天后,共筛选出92个阳性多克隆。然后将这92个阳性克隆转移到24孔培养板上培养一周,筛选出阳性克隆子33个和双阳性克隆子14个,其中三个克隆子(编号zju-11-18, zju-11-71,zju-11-91)用于质粒重组(亚克隆),三个克隆子(编号zju-11-41, zju-11-47, zju-11-50)作为重组备份,八个克隆子(编号zju-11-24, zju-11-28, zju-11-38,zju-11-61, zju-11-65, zju-11-70, zju-11-82, zju-11-84)用于冻存。最终选取一个sub克隆子(zju-11-71)进行单克隆抗体生产。制备的单克隆抗体经Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化后,用PBS溶液溶解,其终浓度为1.78mg/mL。SDS-PAGE纯度分析结果表明,该溶液中没有其他杂蛋白。所获得的单克隆抗体的效价达到32000倍,且其对目标抗原的亲和常数为Ka=2.69×109M-1。该抗体与Cry1Ab蛋白无明显交叉反应,仅当Cry1c蛋白包被浓度为1000ng/mL时有微量交叉反应。4.抗体辣根过氧化物酶(peroxidase horseradish, HRP)标记及其工作浓度的确定采用过改良过碘酸钠法将抗体和HRP酶进行偶联,结果表明抗体与HRP成功偶联,多抗-HRP工作浓度为1：200,单抗-HRP工作浓度为1：320。5. ELISA检测方法的对比试验建立了三种ELISA方法,分别为间接ELISA,单抗-抗原-酶标多抗夹心ELISA和多抗-抗原-酶标单抗夹心ELISA,分析对比三者的灵敏度、线性检测范围确定比较理想的ELISA.其中间接ELISA方法的最低检测限为50ng/mL,其线性检测范围为100-400ng/mL;单抗-抗原-酶标多抗夹心ELISA其最低检测限为0.24ng/mL,其线性检测范围为0.975～62.5ng/mL;多抗-抗原-酶标单抗夹心ELISA其最低检测限为1.95ng/mL,其线性检测范围为3.9～62.5ng/mL。单抗-抗原-酶标多抗的检测限浓度最低,线性检测范围最广,因此单抗-抗原-酶标多抗法是比较理想的一种ELISA方法。6. ELISA检测方法的适用性从交叉反应、回收率试验、实物样品检测等方面来对所获得的ELISA方法的特异性、精确度和准确性进行了分析。结果表明：ELISA检测体系中所使用的兔抗体系与其他Bt蛋白(如Cry1Ab, Cry1c蛋白)无明显交叉反应。采用外标法检测水稻叶片,ELISA分析结果显示其回收率可达89.2～121.92%,且其平均回收率可达103.35%。对转基因样品的检测结果显示,阳性样品检测结果为阳性,阴性样品检测结果为阴性,因此该ELISA方法能够有效地识别转基因样品中的Cry1Ac蛋白。上述试验表明,研究所开发的ELISA检测体系能够满足对Cry1AC蛋白的检测要求,具有潜在的应用前景。

全文目录


致谢  7-8
摘要  8-11
Abstract  11-14
目录  14-17
第一章 文献综述  17-27
  1.1 Bt蛋白简介  17-18
  1.2 转基因食品研究进展  18-19
  1.3 转基因食品检测的意义  19
  1.4 转基因食品检测方法及其应用  19-24
    1.4.1 PCR、ELISA及其比较  20-22
      1.4.1.1 PCR技术  20
      1.4.1.2 ELISA技术  20-21
      1.4.1.3 PCR技术与ELISA技术的比较  21-22
    1.4.2 PCR在转基因食品检测中的应用  22-23
    1.4.3 ELISA在转基因食品检测中的应用  23-24
  1.5 本课题研究意义与目的  24-25
  1.6 本课题研究内容及技术路线  25-27
    1.6.1 研究内容  25-26
    1.6.2 技术路线  26-27
第二章 多克隆抗体的制备及鉴定  27-36
  2.1 实验材料  27-29
    2.1.1 主要实验试剂  27-28
    2.1.2 主要实验设备  28-29
    2.1.3 实验材料  29
  2.2 实验方法  29-32
    2.2.1 蛋白浓度的测定  29
    2.2.2 Cry1Ac蛋白纯度分析  29
    2.2.3 多抗血清的制备  29-30
    2.2.4 多抗血清效价的测定  30-31
    2.2.5 多抗血清的纯化  31
    2.2.6 多克隆抗体纯度分析  31-32
  2.3 结果与分析  32-35
    2.3.1 蛋白浓度的测定  32
    2.3.2 Cry1Ac蛋白纯度分析  32-33
    2.3.3 多抗血清效价的测定  33-34
    2.3.4 多克隆抗体的纯化  34
    2.3.5 多克隆抗体纯度  34-35
  2.4 本章小结  35-36
第三章 单克隆抗体的制备和鉴定  36-49
  3.1 实验材料  36-38
    3.1.1 主要实验试剂  36-37
    3.1.2 主要实验设备  37-38
    3.1.3 实验动物  38
    3.1.4 实验细胞  38
  3.2 实验方法  38-41
    3.2.1 细胞融合和杂交瘤细胞的筛选  38-40
      3.2.1.1 细胞融合  38-39
      3.2.1.2 杂交瘤细胞的筛选  39-40
    3.2.2 单克隆抗体的纯化及鉴定  40
    3.2.3 单克隆抗体效价的测定  40-41
    3.2.4 单克隆抗体亲和常数的测定  41
    3.2.5 抗Cry1Ac蛋白兔单克隆抗体与其他Bt-Cry蛋白的交叉反应  41
  3.3 实验结果与分析  41-48
    3.3.1 免疫效果测定  41-42
    3.3.2 杂交瘤细胞筛选  42-44
    3.3.3 单克隆抗体的纯化  44-45
    3.3.4 单克隆抗体纯度鉴定  45-46
    3.3.5 单克隆抗体效价测定  46
    3.3.6 抗体亲和常数  46-47
    3.3.7 兔单克隆抗体与其他Bt-Cry蛋白之间的交叉反应  47-48
  3.4 本章小结  48-49
第四章 Cry1Ac蛋白ELISA检测方法的建立  49-62
  4.1 实验材料  49-51
    4.1.1 主要实验试剂  49-50
    4.1.2 主要实验设备  50-51
  4.2 实验方法  51-54
    4.2.1 HRP酶标抗体的制备  51
    4.2.2 酶标抗体工作浓度的确定  51-52
    4.2.3 间接ELISA测抗原  52
    4.2.4 双抗夹心ELISA  52-53
    4.2.5 ELISA检测方法与其他Bt蛋白的交叉反应  53
    4.2.6 粗提取水稻叶片蛋白  53
    4.2.7 ELISA检测方法精确度测定  53
    4.2.8 ELISA检测方法准确性测定  53-54
  4.3 实验结果与分析  54-60
    4.3.1 酶标抗体工作浓度的确定  54
    4.3.2 间接ELISA测抗原  54-55
    4.3.3 双抗夹心ELISA  55-57
    4.3.4 三种ELISA检测方法的比较  57
    4.3.5 单抗-抗原-酶标多抗夹心ELISA方法的适用性  57-60
      4.3.5.1 ELISA方法的特异性  58
      4.3.5.2 ELISA方法的精确性  58-59
      4.3.5.3 ELISA方法准确性的初步分析  59-60
  4.4 本章小结  60-62
第五章 结论与展望  62-66
  5.1 抗原纯度及浓度分析测定  62
  5.2 多抗血清纯化及多克隆抗体制备  62
  5.3 杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备  62-63
  5.4 抗体HRP标记及其工作浓度的确定  63
  5.5 ELISA方法的建立  63
  5.6 ELISA方法适用性  63-64
  5.7 创新性  64
  5.8 实验展望  64-66
参考文献  66-73
作者简介  73

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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