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抗弓形虫单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立

作　者: 段张秀
导　师: 宁长申；张龙现
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 弓形虫单克隆抗体杂交瘤夹心ELISA
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

为建立弓形虫病标准、准确、快速的免疫诊断体系及亚单位疫苗的研制,为弓形虫抗原的分离和纯化及探索弓形虫的保护性免疫等研究提供适宜的工具,本研究利用经淋巴细胞分离液密度梯度离心、微孔滤膜过滤、多次低速离心提纯的弓形虫速殖子,再通过反复冻融和超声波处理后作为抗原免疫Balb/c小鼠6次,获得针对弓形虫速殖子的抗体。间接ELISA检测结果显示,6免后抗体效价均达到1：6400以上。本次建立的间接ELISA方法,其主要条件如下：0.5μg·mL-1的弓形虫速殖子为包被抗原,1%牛血清白蛋白为封闭剂,1：5000稀释HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗,TMB(3,3,5,5-四甲基联苯)作为底物。实验证明,该方法特异性强,有较好的重复性。用该法对弓形虫速殖子免疫小鼠的血清抗体及其杂交瘤细胞单抗上清进行检测,获得满意的效果。以PEG2000为促融剂,取效价高的免疫小鼠脾细胞与NSO骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA方法筛选阳性孔,有限稀释法进行3-4次克隆和亚克隆,获得4株能稳定分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3A3、3G3、4F4、4G3),1株单抗腹水(3A3)。经鉴定,4株杂交瘤细胞株的上清效价分别在1：800-12800之间,1株腹水(3A3)效价在1：51200,且稳定性良好,单抗亚类为IgG1,与猪等孢子球虫、猪隐孢子虫、猪旋毛虫、猪蛔虫等无特异性。采用免疫荧光法对腹水进行初步鉴定,发现均为抗速殖子单抗。单抗的腹水提纯后进行SDS-PAGE和Westen-blotting分析,单抗的分子量均约为45kDa。用3A3A5单抗包板酶标板与猪抗弓形虫抗体建立夹心ELISA方法,单抗的最佳稀释度为1：800,猪抗弓形虫高免血清的最佳稀释度为1：100-200。特异性试验表明：该方法对于同属于孢子虫属的猪等孢子球虫、猪隐孢子虫、猪旋毛虫、猪蛔虫有较高的识别力,其OD450nm值则显著偏低。该方法不受其它外界因素的影响,灵敏度高,特异性强,对于临床诊断和公共卫生学将是一种简便、可靠的检测方法,为下一步建立弓形虫病快速诊断体系奠定了基础。

全文目录

致谢  4-7
中文摘要  7-8
文献综述  8-20
  1 弓形虫抗原研究进展  8-14
    1.1 免疫保护性抗原  8-11
    1.2 免疫诊断抗原  11-14
  2 宿主感染后的免疫效应  14-16
    2.1 细胞免疫  14-15
    2.2 体液免疫  15-16
  3 免疫诊断研究  16-19
    3.1 抗体的检测  17-18
    3.2 抗原的检测  18-19
  4 单克隆抗体的应用  19
    4.1 应用于诊断  19
    4.2 应用于免疫治疗  19
  5 结语  19-20
试验一辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的制备  20-30
  引言  20
  1 材料与方法  20-27
    1.1 材料及主要试剂  20-21
    1.2 试剂的配制  21-24
    1.3 耗材及主要仪器  24-25
    1.4 方法  25-27
  2 结果与分析  27-28
    2.1 饱和硫酸铵盐析法提纯猪血清IgG含量及纯度  27
    2.2 羊抗猪IgG的制备及标记结果  27-28
    2.3 辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗猪IgG结合物中HRP与抗体量的测定结果  28
    2.4 辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗猪IgG最佳工作浓度的确定结果  28
    2.5 酶标抗体的保存  28
  3 结论与讨论  28-30
    3.1 饱和硫酸铵盐析法的优点  28-29
    3.2 酶标抗体制备中出现的问题  29-30
试验二抗弓形虫单克隆抗体的制备与鉴定  30-53
  1 材料与方法  30-41
    1.1 主要试剂  30-31
    1.2 试剂的配制  31-34
    1.3 动物与细胞  34
    1.4 耗材及主要仪器  34-35
    1.5 方法  35-41
  2 结果与分析  41-48
    2.1 弓形虫速殖子的纯化  41-42
    2.2 检测抗弓形虫抗体间接ELISA方法的建立  42-45
    2.3 杂交瘤细胞株的建立  45-46
    2.4 单抗的鉴定  46-48
  3 结论与讨论  48-53
    3.1 弓形虫速殖子的纯化  48-49
    3.2 免疫原制备方法不同,影响其免疫源性及所得单抗类型  49
    3.3 影响细胞融合的原因  49-51
    3.4 关于蛋白电泳中的杂带  51
    3.5 免疫学诊断方法的建立  51
    3.6 单克隆抗体的特异性  51-53
实验三单抗介导的夹心ELISA方法的建立  53-60
  1 材料与方法  53-56
    1.1 材料  53
    1.2 方法  53-56
  2 结果与分析  56-58
    2.1 McAbT.gondii-3A3A5介导夹心ELISA方法的特异性和灵敏性  56-57
    2.2 McAbT.gondii-3A3A5介导夹心ELISA方法的重复性试验  57
    2.3 McAbT.gondii-3A3A5介导夹心ELISA用于弓形虫病猪不同组织的检测结果  57
    2.4 McAb T.gondii-3A3A5介导夹心ELISA对弓形虫病血清循环抗原的检测结果  57-58
  3 结论与讨论  58-60
    3.1 单抗的种属特异性  58
    3.2 弓形虫的诊断方法  58-60
小结  60-61
参考文献  61-69
英文摘要  69-71
个人简历  71

抗弓形虫单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立

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