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抗猪隐孢子虫（Cryptosporidium suis）单克隆抗体的研制及初步应用

作　者: 安春霞
导　师: 宁长申；张龙现
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪隐孢子虫单克隆抗体鉴定 ELISA 免疫荧光 18SrRNA基因检测
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究对郑州某猪场分离的猪源隐孢子虫(Cryptosporidium)进行鉴定以确定种类和基因型。将分离株卵囊经仔猪传代和纯化后,制备免疫抗原,经细胞融合建立了抗猪源隐孢子虫单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对制备的单克隆抗体进行生物学特性研究,建立了由单抗介导的间接免疫荧光检测方法。用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对郑州某猪场的隐孢子虫分离株进行了形态学检查和卵囊大小测定,卵囊在饱和蔗糖溶液中呈粉红色,卵囊壁光滑无色薄而均匀;经改良抗酸染色后,卵囊呈玫瑰红色,轮廓呈球形或椭圆形。卵囊大小为4.48～5.0μm×4.02～4.48μm,平均为4.74μm×4.25μm,卵囊形状指数(长/宽)为1～1.10。用巢式PCR扩增该分离株18S rRNA基因部分片段,并进行PCR产物测序,所测序列用Blast在核酸序列数据库中搜索同源序列,利用Clustal X1.81进行序列比对修正,结果显示该序列与猪隐孢子虫(C.suis)参考序列同源率100%。该分离株感染7日龄仔猪,表现轻度腹泻,卵囊在仔猪体内潜伏期为3～4d,排卵囊高峰期在感染后7～21d,持续时间在35d。根据以上鉴定结果确定该猪源隐孢子虫分离株为猪隐孢子虫(C.suis)。用饱和蔗糖溶液漂浮法收集猪隐孢子虫卵囊,然后用蔗糖梯度离心法进行卵囊纯化。将得到的纯净卵囊反复冻融和超声波处理制备抗原,免疫BALB/c小鼠。在PEG1000作用下,将隐孢子虫抗体阳性的免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合;经间接ELISA法阳性筛选,3次有限稀释法克隆;获得3株能稳定分泌抗猪隐孢子虫McAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为1E1C5、1E11A5、2B7A1。用间接ELISA叠加试验、间接免疫荧光试验鉴定单抗的反应性。结果显示三株单抗分别属于IgM、IgG3和IgG2a类;其细胞培养上清效价分别为1:3200、1:1600和1:3200,小鼠腹水效价分别为1:1.6×105、1:1.6×105和1:0.8×105;ELISA叠加试验表明3株单抗可识别两个不同抗原位点,1E1C5有较高的亲和力;免疫荧光试验结果显示3株单抗均针对猪隐孢子虫卵囊壁抗原决定簇,能与猪隐孢子虫卵囊壁反应,但与艾美耳球虫(Eimeria)、人隐孢子虫(C.hominis)有微弱的交叉反应。本试验获得了3株可识别猪隐孢子虫卵囊壁的单克隆抗体,为进一步开展猪隐孢子虫快速诊断研究奠定了基础。本试验用已建立的抗猪隐孢子虫单克隆抗体1E1C5为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗建立了检测猪隐孢子虫的间接免疫荧光检测方法。单抗的稀释液用1%BSA,最佳稀释度为1:400,最佳作用时间为60min。二抗的最佳稀释度为1:400,最佳作用时间为45min。该方法不与环孢子虫(Cyclospora)、C.andersoni、C.parvum、C.baileyi卵囊和贾第虫(Giardia)包囊发生交叉反应,仅与鸡艾美耳球虫和C.hominis卵囊发生较弱的交叉反应,对猪隐孢子虫卵囊的检测阈值为250个·mL-1。用该方法和改良抗酸染色法同时对50份猪粪便样品进行隐孢子虫检测,结果显示,IFA和改良抗酸染色法检出了共同的9个样品为隐孢子虫阳性,而IFA检出了另外3份卵囊含量极少的样品。研究结果表明该方法具有较好的敏感性和特异性,为猪隐孢子虫的检测提供了更加便捷的方法。

全文目录

致谢  4-7
摘要  7-9
文献综述  9-22
  1 隐孢子虫有效种及分类情况  10-13
  2 猪隐孢子虫流行特点及现状  13-15
  3 隐孢子虫免疫抗原成分  15-17
  4 隐孢子虫病的免疫特点  17-19
  5 隐孢子虫病的免疫学诊断  19-21
  6 防治  21-22
试验一猪源隐孢子虫的种类鉴定  22-30
  1 材料与方法  22-25
    1.1 卵囊的形态学检查  22-23
    1.2 18SrRNA 基因序列分析鉴定  23-24
    1.3 仔猪传代感染试验  24-25
  2 结果与分析  25-28
    2.1 卵囊的形态结构  25-26
    2.2 18SrRNA 基因扩增测序结果  26-27
    2.3 仔猪传代感染试验结果  27-28
  3 结论与讨论  28-30
    3.1 猪隐孢子虫的形态学鉴定  28
    3.2 基于18SrRNA 分析对猪隐孢子虫的鉴定  28-29
    3.3 猪源隐孢子虫感染仔的排卵囊情况  29-30
试验二抗猪隐孢子虫(Cryptosporidium suis)单克隆抗体的制备与鉴定  30-49
  1 材料与方法  30-39
    1.1 材料  30-31
    1.2 试剂配制  31-34
    1.3 方法  34-39
  2 结果分析  39-45
    2.1 卵囊纯化  39-40
    2.2 间接ELISA 方法的建立  40-42
    2.3 杂交瘤细胞株的建立  42-43
    2.4 单克隆抗体的鉴定  43-45
  3 结论与讨论  45-49
    3.1 卵囊纯化  45-46
    3.2 隐孢子虫抗体检测方法的建立  46
    3.3 细胞融合  46-47
    3.4 杂交瘤细胞株的筛选和亚克隆  47
    3.5 单抗的鉴定  47-49
试验三单抗介导的间接免疫荧光检测方法的建立  49-56
  1 材料与方法  49-51
    1.1 材料  49
    1.2 方法  49-51
  2 结果分析  51-53
    2.1 单抗工作浓度和孵育时间的测定结果  51
    2.2 单抗稀释液的选择结果  51-52
    2.3 FITC 标记二抗工作浓度测定结果  52
    2.4 抗原阻断试验结果  52
    2.5 属间和种间特异性试验结果  52-53
    2.6 IFA 检测隐孢子虫的敏感性试验结果  53
    2.7 临床样品的检测结果  53
  3 结论与讨论  53-56
    3.1 免疫荧光检测方法在检测隐孢子虫卵囊中的应用  53-54
    3.2 IFA 检测方法的特异性  54
    3.3 IFA 检测方法的敏感性  54-56
参考文献  56-64
英文摘要  64-65

抗猪隐孢子虫（Cryptosporidium suis）单克隆抗体的研制及初步应用

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