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无细胞系统原位制备蛋白质芯片及新型离子液体修饰电极的制备

作　者: 赵瑞军
导　师: 孙伟
学　校: 青岛科技大学
专　业: 分析化学
关键词: 蛋白质微阵列无细胞合成酪胺信号放大技术室温离子液体化学修饰电极
分类号: Q503
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蛋白质微阵列具有高通量、微型化、集成化等特点,因而常用于蛋白质组学研究中对于生物化学和分子生物学的多元化和平行化检验。传统的蛋白质微阵列需要通过基因克隆、表达、纯化、点样等步骤,程序繁琐、费时费力、成本较高,已成为蛋白质芯片技术发展的瓶颈。为解决这些难题,我们设计了一种新方法,先将PCR扩增的基因固定在基底芯片上,再利用无细胞蛋白质合成系统将其转变成蛋白质微阵列。这种生物素标记的DNA和生物素标记的抗GST抗体可以与预先固定在醛基玻片上的链亲和素结合而固定在芯片上。以无细胞蛋白质合成系统孵育后,原位无细胞合成的GST标签蛋白被抗GST标签抗体捕获而固定在芯片上。然后对蛋白质进行进一步纯化,并用探针检测,同时对蛋白质活性进行了研究并进行初步定量分析,初步估算12个基因表达的蛋白质产量在0.35 ~ 4.0 fmol/点之间。考察了利用酪胺信号放大技术(TSA)检测的效果。本文以鼠IgG为研究对象,对TSA技术进行了考察,与传统荧光检测相比,TSA技术对鼠IgG的检测限提高约100倍。室温离子液体(RTILs)具有特殊的理化性质,在电分析化学领域它既可以作为溶剂和支持电解质,又可以作为粘合剂和固定材料用于制备修饰电极。本文利用两种不同性质的离子液体制备了修饰电极,研究内容如下:1以1-乙基3-甲基咪唑四氟硼酸盐(EMIMBF4)为粘合剂制备离子液体碳糊电极(CILE),并以此为基底电极在亚甲基蓝单体溶液中电化学聚合制备了聚亚甲基蓝膜修饰电极,研究了聚亚甲基蓝膜修饰电极的形貌并对其进行了表征。同时研究了其对酚类化合物3,4-二羟基苯甲酸的电催化行为,其催化的峰电流与3,4-二羟基苯甲酸的浓度在5.0×10-4 ~ 3.0×10-2 mol/L呈线性关系,检测限为1.72×10-4 mol/L (3σ)。2将室温离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)和Nafion混合后形成一种新型的复合膜材料,利用该膜材料将Mb固定于传统碳糊电极(CPE)上,详细考察了Mb在Nafion-BMIMPF6复合膜中的电化学行为。结果表明循环伏安扫描出现一对峰形良好且准可逆的氧化还原峰,为Mb Fe(III)/Fe(II)的特征峰,求解了相关的电化学参数。该修饰电极对三氯乙酸表现出较好的电催化性能,其催化的还原峰电流与三氯乙酸的浓度在2.0×10-4 ~ 1.1×10-2 mol/L范围内呈线性关系,检测限为1.6×10-5 mol/L (3σ)。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一部分无细胞系统原位制备蛋白质芯片  11-54
  第一章前言  11-31
    1.1 蛋白质芯片技术的原理  11-12
    1.2 蛋白质芯片技术的特点  12-13
    1.3 蛋白质芯片的分类  13-14
      1.3.1 蛋白质微阵列芯片  13
      1.3.2 微孔板蛋白质芯片  13
      1.3.3 三维凝胶块芯片  13-14
    1.4 蛋白质芯片的制备  14-15
    1.5 无细胞系统原位制备蛋白质芯片  15-21
      1.5.1 无细胞系统简介  15-17
      1.5.2 无细胞系统制备蛋白质芯片的方法  17-21
    1.6 蛋白质芯片检测的方法  21-22
      1.6.1 间接检测法  21
      1.6.2 直接检测法  21
      1.6.3 信号放大检测法  21-22
    1.7 蛋白质芯片的应用  22-24
      1.7.1 蛋白表达谱的分析  22
      1.7.2 蛋白质相互作用的分析  22-23
      1.7.3 药物学中的研究  23
      1.7.4 在医学诊断中的应用  23-24
    1.8 本论文的基本思路和目的  24-25
    参考文献  25-31
  第二章酪胺信号放大方法应用于蛋白质芯片的研究  31-38
    2.1 材料和方法  32
      2.1.1 仪器与试剂  32
      2.1.2 蛋白质芯片的制备  32
    2.2 结果讨论  32-36
      2.2.1 蛋白质芯片制作和检测的原理  32-33
      2.2.2 鼠IgG 芯片的酪胺信号放大  33-34
      2.2.3 HRP 标记羊抗鼠IgG 浓度的优化  34-35
      2.2.4 Cy3-Tyramide 浓度的优化  35-36
    2.3 本章小结  36-37
    参考文献  37-38
  第三章无细胞系统原位制备蛋白质芯片  38-54
    3.1 实验部分  39-42
      3.1.1 仪器与试剂  39-40
      3.1.2 实验方法  40-42
        3.1.2.1 引物设计及合成  40
        3.1.2.2 提取质粒克隆  40
        3.1.2.3 基因的PCR 扩增  40-41
        3.1.2.4 PCR 产物的纯化  41-42
        3.1.2.5 原位表达操作步骤  42
    3.2 结果与讨论  42-52
      3.2.1 无细胞系统原位制备蛋白质芯片的设计原理  42-43
      3.2.2 生物素标记基因浓度的优化  43-44
      3.2.3 不同抗体检测多基因共表达蛋白  44-45
      3.2.4 酶切效果的检验  45-47
      3.2.5 p53 蛋白与MDM2 的相互作用  47-48
      3.2.6 PCR 产物与纯化后基因表达的比较  48-50
      3.2.7 无细胞原位蛋白质合成的重现性  50-51
      3.2.8 蛋白质表达的定量检测  51-52
    3.3 本章小结  52-53
    参考文献  53-54
第二部分新型离子液体修饰电极的制备  54-75
  第四章聚亚甲基蓝修饰电极的制备及应用  54-65
    4.1 实验部分  55-56
      4.1.1 仪器与试剂  55-56
      4.1.2 试验方法  56
        4.1.2.1 CILE 的制备  56
        4.1.2.2 聚亚甲基蓝修饰电极的制备  56
    4.2 结果与讨论  56-62
      4.2.1 扫描电子显微镜图  56-57
      4.2.2 电化学交流阻抗图  57
      4.2.3 亚甲基蓝电化学聚合条件的优化  57-58
      4.2.4 亚甲基蓝的电化学聚合  58-59
      4.2.5 3, 4-二羟基苯甲酸在PMB 修饰电极上的电化学行为  59-62
      4.2.6 电极的重现性和稳定性  62
    4.3 本章小结  62-63
    参考文献  63-65
  第五章肌红蛋白在Nafion和离子液体BMIMPF_6复合膜中的直接电化学行为  65-75
    5.1 实验部分  65-66
      5.1.1 仪器与试剂  65-66
      5.1.2 Nafion-BMIMPF_6/Mb/CPE 的制备  66
    5.2 结果与讨论  66-73
      5.2.1 电化学交流阻抗曲线  66-67
      5.2.2 傅立叶变换红外光谱图  67
      5.2.3 紫外可见吸收光谱图图  67-69
      5.2.4 Nafion-BMIMPF_6/Mb/CPE 的直接电化学  69-71
      5.2.5 pH 值对Mb 电化学的影响  71-72
      5.2.6 电催化还原TCA  72-73
    5.3 本章小结  73-74
    参考文献  74-75
附录  75-77
结论  77-78
致谢  78-79
攻读学位期间已发表和待发表的相关学术论文题录  79-80

无细胞系统原位制备蛋白质芯片及新型离子液体修饰电极的制备

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