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C57BL/6J小鼠肝脏磷酸化蛋白质组研究技术方法构建及应用

作　者: 迟明
导　师: 蔡耘
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析学
关键词: 二氧化钛富集天冬氨酸鼠肝磷酸化蛋白质组
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蛋白质的磷酸化修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程是细胞内信号转导、基因表达等诸多生命过程中最普遍也是最重要的调控手段之一[1],在生物学功能研究领域受到广泛的关注。以质谱技术为核心的磷酸化蛋白质组学研究的方法可以系统、规模化地对复杂体系中的磷酸化蛋白质进行定性及定量分析,从而为与蛋白质磷酸化相关的各种生物学功能研究提供通量化的技术平台和极有价值的数据集。但由于蛋白质的磷酸化修饰含量少、化学计量值低、质谱检测离子化效率低,使得磷酸肽的质谱检测较为困难,且在复杂生物样本中大量高丰度、非磷酸化肽段的存在进一步抑制了磷酸肽的质谱信号,若对生物样品直接进行质谱分析,磷酸肽的检出率较低,因此在质谱检测前,对磷酸化肽段进行相对的分离富集是必不可少的步骤之一。金属氧化物富集法,特别是二氧化钛富集法,由于对磷酸肽富集效果好,且价格低廉,操作简便,是使用最为广泛的磷酸肽富集方法之一。但是由于二氧化钛除了可以吸附磷酸基团,对天冬氨酸(D)及谷氨酸(E)这样的酸性氨基酸也有一定的吸附作用。因而在富集磷酸肽的同时,富含天冬氨酸及谷氨酸残基的非磷酸肽也常常随着磷酸肽一起被富集,对磷酸肽的质谱检测造成一定的干扰。为了减少这些非磷酸肽与二氧化钛的结合,常常在上样缓冲液中加入一些非磷酸肽吸附抑制剂来降低样本的非特异性吸附,从而提高富集的选择性。本研究对二氧化钛这种常用的金属氧化物富集法进行了富集条件的优化,引入天冬氨酸作为新型的非磷酸肽吸附抑制剂,并使用复杂生物样本对优化的富集条件进行了评价。使用这种经过优化的富集方法结合聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离方法,得到了模式生物C57/BL6J小鼠肝脏磷酸化蛋白质组学数据集,并在此基础上进一步对小鼠肝脏部分细胞器磷酸化蛋白质组学数据集进行了大规模的获取及相应的生物信息学分析。该种模式生物的肝脏磷酸化蛋白质组学研究尚属空白,数据获取及相应的数据分析对后续深入研究磷酸化蛋白在肝脏生理过程中的重要作用奠定了坚实的基础。论文第一部分,论述了在前期工作的基础上,对二氧化钛富集磷酸肽方法进行了进一步优化和评价,确立了以天冬氨酸作为新型非磷酸肽吸附抑制剂的二氧化钛富集方法。作者分别使用3种、9种标准蛋白混合物作为研究对象,比较了不同的非磷酸肽吸附抑制剂在相同反应条件下的冗余/非冗余肽段及选择性情况,证明了天冬氨酸作为非磷酸肽吸附抑制剂的有效性及优越性。此后,将优化后的该方法用于富集鼠肝全蛋白混合酶切肽段产物,同样取得了很好的效果。富集的选择性较未添加非磷酸肽吸附抑制剂有着显著的提高。进一步证实了使用该种非磷酸肽吸附抑制剂的优化的富集方法在复杂样本中应用的可靠性。论文第二部分,论述了使用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法作为预分离的手段,结合优化后的二氧化钛富集方法获取了C57BL/6J小鼠肝脏全蛋白磷酸化修饰谱数据集。作者采用制备级凝胶电泳分离小鼠肝脏全蛋白提取物,经过考马斯亮蓝染色方法显色,将凝胶等分为15个条带组分并分别进行酶解,使用第一部分中优化的二氧化钛富集方法对胶内提取的肽段进行富集并进行质谱检测。为了获得更加全面准确的数据集,我们对数据检索条件进行了相应的优化,最终确定最佳数据检索条件为:母离子质量精度设置为10 ppm,胰酶酶切方式设置为全酶切,子离子质量精度设置为0.8 Da。通过该种最优检索条件,共获得1778个非冗余磷酸化肽段, 2417个磷酸化位点和1031个磷酸化蛋白;鉴定到的磷酸化位点中丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的比例分别为85%、13%、2%,符合文献报道范围。此外还进行了GO分类等一些简单的数据分析。本部分实验结果及分析证明了该技术路线用于大规模获取磷酸化蛋白质组学数据的可行性和有效性。论文第三部分,论述了使用已确立并成功获取小鼠肝脏全蛋白磷酸化蛋白质组学数据集的技术路线,对C57BL/6J小鼠肝脏部分细胞器进行了分离和磷酸化谱数据集的获取。将全蛋白与细胞器数据整合后,共获得2442个非冗余磷酸化肽段,3394个磷酸化位点和1402个磷酸化蛋白。针对该数据集,作者进行了深入系统的生物信息学分析,如数据集间的比对分析、GO分类、Motif分析、通路分析、novel磷酸化位点及相应蛋白功能分析等。

全文目录

缩略词表  7-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-17
  1.1 翻译后修饰及磷酸化  12
  1.2 磷酸化蛋白质组学概况  12-13
  1.3 磷酸化研究中分离富集技术概况  13-16
    1.3.1 样本的初分离  13-14
    1.3.2 磷酸化蛋白/肽的富集  14-16
  1.4 本论文的研究内容  16-17
2 优化的二氧化钛富集磷酸肽方法的评价  17-24
  2.1 材料与仪器  17-18
  2.2 实验方法  18-20
    2.2.1 标准蛋白质混合物的制备  18
    2.2.2 C57BL/6J 小鼠肝脏蛋白质的制备  18
    2.2.3 蛋白质酶切产物的制备  18
    2.2.4 酶切产物的脱盐  18-19
    2.2.5 酶切产物磷酸肽的富集  19
    2.2.6 分析条件  19-20
  2.3 结果与讨论  20-23
    2.3.1 天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂的原理  20-21
    2.3.2 天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂对标准蛋白磷酸肽的富集效果的评价  21-22
    2.3.3 天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂对复杂生物样本中磷酸肽的富集效果  22-23
    2.3.4 样本的复杂程度对天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂效果的影响  23
  2.4 本章小结  23-24
3 C57BL/6J 小鼠肝脏全蛋白磷酸化修饰谱数据集的获得  24-33
  3.1 材料与仪器  24-25
  3.2 实验方法  25-26
    3.2.1 C57BL/6J 小鼠肝脏蛋白质的制备  25
    3.2.2 制备级聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色  25
    3.2.3 凝胶的切取及蛋白酶切产物的制备  25
    3.2.4 酶切产物磷酸肽的富集  25
    3.2.5 分析条件  25-26
    3.2.6 数据检索  26
  3.3 结果与讨论  26-33
    3.3.1 技术路线的确立  26-27
    3.3.2 搜库条件的优化  27-29
    3.3.3 数据集呈现及初步数据分析  29-32
      3.3.3.1 获得的鼠肝全蛋白磷酸化蛋白质组学数据集  29
      3.3.3.2 初步数据分析  29-32
    3.3.4 技术路线的实际应用效果  32-33
  3.4 本章小结  33
4 C57BL/6J 小鼠肝脏细胞器磷酸化修饰谱数据集的获得及分析  33-49
  4.1 材料与仪器  33-34
  4.2 实验方法  34-35
    4.2.1 C57BL/6J 小鼠肝脏细胞器蛋白质的制备  34-35
    4.2.2 制备级聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色  35
    4.2.3 凝胶的切取及蛋白酶切产物的制备  35
    4.2.4 酶切产物磷酸肽的富集  35
    4.2.5 分析条件  35
    4.2.6 数据检索  35
  4.3 结果与讨论  35-48
    4.3.1 细胞器分离的意义  35-36
    4.3.2 数据集呈现及数据分析  36-48
      4.3.2.1 获得的鼠肝细胞器磷酸化蛋白质组学数据集  36-38
      4.3.2.2 数据分析  38-48
  4.4 本章小结  48-49
5 全文总结  49-50
参考文献  50-54
个人简历  54-55
在学期间发表论文  55-56
致谢  56-58
附 1:与学位论文密切相关的文献综述  58-94

C57BL/6J小鼠肝脏磷酸化蛋白质组研究技术方法构建及应用

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