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UVB诱导MEF细胞miR-365/465的表达及其信号通路的初步研究

作　者: 高素珍
导　师: 丁振华
学　校: 南方医科大学
专　业: 放射医学
关键词: miR-365 miR-465 UVB MEF p53 real-time-PCR
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究背景及目的太阳辐射中的紫外线根据波长可分为长波紫外线(UVA 320-400nm)、中波紫外线(UVB 280-320nm)和短波紫外线(UVC 100-280nm)。臭氧层能有效吸收全部的UVC和约95%的UVB, UVA则不能被吸收。虽然到达地面的UVB相对于UVA只占很小的比例,但由于皮肤中大多数的生物分子都是UVB辐射的吸收剂,如核酸、芳香族氨基酸等,因此,此波段的紫外线生物学效应最强,长期大剂量照射可引起皮肤癌。作为肿瘤抑制基因的核转录因子,p53基因参与了细胞增殖、细胞凋亡、DNA修复及血管发生等一系列生物过程,是迄今发现的与人类肿瘤关系最为密切的抑瘤基因,几乎所有的人类肿瘤中均存在p53信号通路的异常。UVB诱导的皮肤肿瘤的发生也是一个复杂的连续过程,包括一系列基因如原癌基因、抑癌基因的遗传改变,其中,UVB诱导的肿瘤抑制基因p53的突变被认为是一个较早期的步骤。MicroRNA (miRNA)是一种非编码的内源性小RNA,长约22个核苷酸,可以通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平对基因的表达进行负调控,导致mRNA的降解或翻译抑制,在细胞的增殖、分化、凋亡等过程中具有重要的调节作用。在p53基因活化通路中,多种miRNA成为其活化后下调某些蛋白表达的重要中间分子,miRNA家族成员广泛参与了p53基因信号通路的调控,如miR-34家族、miR-29家族、miR-192和miR-215等。是否还有其他的miRNA分子也受p53基因的调控,或者调控p53信号通路的其他分子呢?在生长抑制的人成纤维细胞WI-38中,存在miR-365的明显下调,在对细胞增殖进行负调控的信号通路中,发现其上游调节因子包括衰老相关的miRNA,而肿瘤抑制基因p53则是此通路的中心。我们前期的研究工作证实,UVB辐射能显著改变NIH3T3细胞中miRNA的表达特性,多种miRNA在不同时间点出现高表达,特别是miR-365在UVB照射后6h的表达升高近7倍,而miR-465在每个时间点的表达都显著下调。但与UVB诱导的miR-365／465表达变化相关的信号通路还未有报道。因此,进一步探讨UVB辐射对miR-365／465表达变化的影响以及肿瘤抑制基因p53可能在UVB诱导的miR-365／465表达变化中的作用,深入认识miR-365／465的功能及其在基因表达调控网络中的作用,寻找其下游靶基因仍有待研究。资料和方法野生型小鼠胚胎成纤维细胞(p53+／+细胞)购自美国典型培养物收藏所(American Type Culture Collection, ATCC),p53缺失小鼠胚胎成纤维细胞(p53-／-细胞)由南方医科大学病理生理学系惠赠。我们用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)对p53+／+和p53-／-这两种细胞进行了验证；用实时荧光定量PCR方法(real-time quantitative PCR)检测了UVB照射后p53+／+和p53-／-细胞中miR-365/465的表达,miRNA的变化以三个复孔的Ct值均值通过ΔCt法进行计算；利用miRBase、PicTar和TargetScan三个经典靶基因预测数据库对miR-365／465的靶基因进行预测,并用生物信息学方法对靶基因进行了初步的基因功能分析。采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,计量资料数据采用均数±标准差(X±S)表示。荧光定量PCR细胞ACt值的比较采用2-ΔΔCt法计算,改变达到2倍以上为差异有显著意义。结果1经50J／m2UVB照射后,miR-365的表达下调,p53+／+细胞在照后4h、6h和24h的表达较对照组分别降低了2.5倍、2倍和2倍,差异有显著性；p53-／-细胞在照后2h、4h和6h的表达较对照组分别降低了2.5倍、3倍和2倍,改变具有显著意义。2经50J／m2UVB照射后,p53+／+细胞中miR-465的表达下调,在照后各时间点其降低都超过2倍；p53-／-细胞中miR-465的表达上调,在照后2h、4h、6h和12h升高均超过2倍,差异有显著意义。3经50J／m2UVB照射后,在对应的时间点,p53-／-细胞中miR-365的表达低于p53+／+细胞,其中对应的2h和4h的差别都超过了2倍；p53-／-细胞中miR-465的表达显著高于p53+／+细胞,差异均具有显著意义。4利用miRBase、Pictar和TargetScan三个经典靶基因预测数据库对miR-365／465的靶基因进行预测,3个数据库预测的miR-365的靶基因取交集后得到32个靶基因,该32个靶基因的生物学功能主要集中在细胞增殖／分化、转录因子活性、细胞增殖的负向调控、细胞增殖的正向调控和氧化应激反应等方面；miR-465的靶基因3个数据库取交集后得到29个靶基因,该29个靶基因的生物学功能主要包括细胞增殖／分化、转录的正向调控、蛋白质磷酸化、受体信号蛋白活性以及GTP酶ARF激活物活性等。结论1 miR-365在UVB照射后表达降低,且具有时间依赖性；p53基因对UVB诱导的miR-365的表达具有正向调节作用,此作用在UVB照射后的早期(4h)最为明显。2 miR-465在UVB照射后的p53+／+细胞中的表达降低,在UVB照射后的p53-／-细胞中表达升高；p53基因对UVB照射后miR-465的表达具有负向调节作用,且此调节作用较持久(达24h)。3生物信息学的分析表明：miR-365／465可能在细胞增殖／分化和转录调节中具有重要的调节功能,另外,miR-365可能与氧化应激有关,miR-465则可能在细胞信号传导中具有重要作用。

全文目录


摘要  3-6
ABSTRACT  6-11
前言  11-17
第1章 P53+/+和P53-/-细胞的验证  17-31
  第1节 p53+/+和p53-/-细胞中p53 mRNA的表达  17-23
  第2节 p53+/+和p53-/-细胞中p53蛋白的表达  23-29
  参考文献  29-31
第2章 UVB照射后MEF细胞中miR-365/465的表达  31-49
  第1节 UVB照射后MEF细胞中miR-365的表达  31-41
  第2节 UVB照射后MEF细胞中miR-465的表达  41-47
  参考文献  47-49
第3章 miR-365/465靶基因预测及生物信息学分析  49-54
  1 材料和方法  49-50
  2 结果  50-54
全文讨论  54-59
全文小结  59-60
硕士期间发表的文章  60-61
综述  61-66
致谢  66-67

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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