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变异链球菌重组质粒pEGFP-N1-SrV+的构建及真核表达

作　者: 于晓光
导　师: 刘建国；陈舟；何奎芳；张疆弢；江策
学　校: 遵义医学院
专　业: 口腔临床医学
关键词: 变异链球菌表面蛋白可变区 DNA疫苗 pEGFP-N1 293T细胞
分类号: R781.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 27次
引　用: 1次
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内容摘要

龋病是一种以细菌为主的多种因素共同作用的牙体硬组织疾病,变异链球菌(S.mutans,简称变链菌)是目前公认的主要致病菌之一。变异链球菌在牙面粘附、聚集、增殖和产酸是其致龋的主要过程,因此,阻断变异链球菌在牙面粘附、聚集,可降低龋病的发生率。目前,免疫学预防措施是控制龋病的重要手段之一。基因疫苗,是上世纪90年代初逐渐发展起来的一种诱导免疫反应的新方法,是预防免疫医学史上的又一座里程碑,被誉为第三次疫苗革命。其基本原理是将外源性基因直接导入宿主细胞内,诱导宿主免疫系统对目的基因所表达的蛋白产生免疫反应,进而达到预防和治疗疾病的目的。变链菌表面蛋白(surface protein antigen, SpaP)是介导变链菌在牙面粘附、聚集的主要功能区。变链菌表面蛋白可变区(SrV+,V区)两端连接着具有高度保守性的A区和P区,并可与A区或P区协同发挥致龋作用。SrV+具有粘附和凝集作用,参与变链菌在牙面粘附、聚集；同时,SrV+内蛋白有B细胞表位,可单独发挥免疫原性；SrV+蛋白还可以通过植物凝集素样物质,刺激单核细胞释放TNF-α因子。因此,变链菌表面蛋白SrV+是其重要的毒性因子,参与致龋过程,SrV+编码基因为srv+。[目的]本研究根据已报道的变链菌表面蛋白SrV+基因srv+的核苷酸序列,化学合成其编码基因,鉴定无误后,将此片段连接到加强型绿色银光蛋白真核表达载体pEGFP-N1中,构建真核表达质粒pEGFP-N1-SrV+,进行瞬时转染哺乳动物细胞293T,并检测其目的蛋白表达情况,为进一步的动物实验研究打下基础。[方法]本研究分为两个实验实验一：重组质粒pEGFP-N1-SrV+的构建根据已报道的srv+基因核苷酸序列,化学合成SrV+的编码基因srv+,将载体质粒pEGFP-N1和测序正确的srv+基因片段分别Kpn I/Xho I双酶切形成粘性末端,进行连接反应,获取重组质粒pEGFP-N1-SrV+,进一步对其进行PCR、酶切和测序鉴定。实验二：重组质粒pEGFP-N1-SrV+在真核细胞中的表达通过脂质体介导重组质粒pEGFP-N1-SrV+瞬时转染至哺乳动物细胞293T。运用免疫组化SABC法和荧光显微镜观察绿色荧光蛋白标记的目的蛋白在真核细胞293T中表达的情况。[结果]通过基因化学合成技术,获得1136bp的目的基因srv+核苷酸序列,与设计的目的基因序列一致；目的基因srv+和载体pEGFP-N1分别双酶切制备后连接,成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-SrV+；PCR扩增可获得1.35Kb目的基因片段；KpnI/XhoI双酶切可见4.7kb和1.1kb两条电泳条带；经测序分析重组质粒pEGFP-N1-SrV+携带目的基因；SrV+的序列与变链菌UA159基因序列比对同源性为96%；通过荧光显微镜观察和免疫组化法检测,质粒pEGFP-N1-SrV+转染真核细胞293T后,在细胞中可见目的蛋白SrV+特异性表达。[结论]成功构建了真核表达重组质粒pEGFP-N1-SrV+,重组粒质转化哺乳动物细胞293T后,能够表达目的蛋白。

全文目录

1 变异链球菌重组质粒pEGFP-N1-SrV+的构建及真核表达  5-45
  1.1 缩略语表  5-6
  1.2 中文摘要  6-8
  1.3 英文摘要  8-10
  1.4 前言  10-13
  1.5 实验一重组质粒pEGFP-N1-SrV+的构建  13-33
    1 材料和方法  13-21
    2 结果  21-29
    3 讨论  29-32
    4 小结  32-33
  1.6 实验二真核表达质粒pEGFP-N1一SrV+在哺乳动物细胞293T中的表达  33-40
    1 材料和方法  33-36
    2 结果  36-37
    3 讨论  37-39
    4 小结  39-40
  1.7 全文总结  40-41
  1.8 参考文献  41-45
2 综述  45-57
  参考文献  53-57
3 致谢  57

变异链球菌重组质粒pEGFP-N1-SrV+的构建及真核表达

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