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鸭瘟病毒UL24基因疫苗的构建及其免疫效果的初步研究

作　者: 舒兵
导　师: 贾仁勇
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭瘟病毒 UL24基因 LTB基因 DNA疫苗 减毒沙门氏菌 口服免疫
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


鸭瘟(Duck Plague, DP)又称鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis, DVE),是由鸭瘟病毒(Duck Plague Virus, DPV)引起的主要危害鸭、鹅等雁行目禽类的一种急性、热性和败血性的接触性传染病。基因疫苗以特有的优势在基因工程疫苗的研究中备受关注。本研究以鸭瘟病毒UL24基因(DPV UL24)为靶基因,以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(E.coli LTB)基因为基因佐剂,进行了DPV基因疫苗的构建与免疫原性研究,获得以下结果：1.E.coli LTB基因的克隆及真核表达质粒的构建采用PCR扩增E.coli K88ac的LTB基因,将其插入pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T/LTB。测序分析表明：克隆的E.coli LTB基因长度为414bp,与GenBank公布的LTB序列(Accession:EU113245.1)相似性为100%。以pVAX1为载体,分别构建了真核表达质粒pVAX1-LTB、pVAX1-UL24以及pVAX1-LTB-UL24。酶切鉴定表明,成功构建了上述三种真核表达质粒。2.重组减毒沙门氏菌的构建及其生物学特性研究将真核表达质粒pVAXl-LTB、pVAX1-UL24和pVAX1-LTB-UL24分别电转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建携带真核表达质粒的重组减毒沙门氏菌SL7207(LTB)、SL7207(UL24)和SL7207(LTB-UL24)。对重组沙门氏菌进行革兰氏镜检和生化试验,并在体外检测重组减毒沙门氏菌的质粒稳定性。结果表明,三种重组减毒沙门氏菌的生物学特性与SL7207一致,且在抗生素环境下16h内,质粒在沙门氏菌内的稳定性在90%以上。将重组减毒沙门氏菌体外感染鸭胚成纤维细胞,通过间接免疫荧光证实：表达质粒pVAX1-UL24和pVAX1-LTB-UL24被有效传递入细胞,且能对目的蛋白进行表达；通过RT-PCR证实：质粒pVAX1-LTB在传递入细胞中进行了有效转录。3.重组减毒沙门氏菌的体内表达及其安全性检测鸭口服SL7207(LTB)+SL7207(UL24)、SL7207(UL24)和SL7207(LTB-UL24)后,分别提取鸭回肠末端肠道细胞总RNA作为模板,通过RT-PCR分别检测到LTB基因、UL24基因和LTB-UL24基因转录。将重组菌SL7207(LTB-UL24)以1×109, 1×1010与1×1011CFU/只的剂量口服免疫鸭,试验组与对照组之间的体重无显著性差异；在免疫后第8w,免疫鸭粪便、肝脏和脾脏检测不出重组减毒沙门氏菌。结果表明,重组减毒沙门氏菌具有良好的安全性。4.鸭瘟病毒UL24基因疫苗免疫原性研究以7日龄雏鸭为试验动物,按照免疫剂量为200μg/只的基因疫苗pVAX1-UL24、pVAX 1-LTB+p VAX 1-UL24和pVAXl-LTB-UL24分别进行雏鸭腿部肌肉注射,免疫剂量为1×1010CFU/只的SL7207(LTB)+SL7207(UL24)、SL7207(UL24)和免疫剂量为1×109、1×1010与1×1011CFU/只的SL7207(LTB-UL24)分别进行口服,间隔两周加强免疫一次,共免疫3次。分别在免疫后1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w和8w通过间接ELISA测定免疫鸭各器官特异性DPV IgG、IgA和IgM抗体水平。结果表明：肌注免疫组能有效诱导体液产生特异性DPV IgG、IgA和IgM,口服免疫组能有效诱导黏膜和体液产生特异性DPV IgG、IgA和IgM,且IgG和IgA在第6w达到高峰,IgM在第5w达到高峰,较对照组差异极显著(P<0.01)。同时,试验组pVAX1-LTB-UL24显著高于试验组pVAX1-UL24 (P<0.05),试验组SL7207(LTB-UL24)显著高于试验组SL7207(UL24) (P<0.05);试验组SL7207(LTB-UL24) 1×1011CFU免疫剂量组显著高于试验组SL7207(LTB-UL24) 1×109CFU免疫剂量组(P<0.05),和高于试验组SL7207(LTB-UL24) 1×1010CFU免疫剂量组。结果显示：鸭瘟病毒UL24基因疫苗具有良好的免疫原性,LTB基因具有良好的佐剂效应,以减毒沙门氏菌为载体的基因疫苗免疫原性与免疫剂量有关。5.鸭瘟病毒UL24基因疫苗免疫保护效果研究鸭瘟病毒UL24基因疫苗免疫后第6w,以1000 LD50 DPV强毒CHv株口服感染试验鸭,观察鸭死亡情况。结果表明：口服免疫组存活率较对照组显著提高,其中SL7207(LTB-UL24) 1×1011CFU达80%,高于肌注免疫组40%的存活率,且显著高于对照组10%的存活率(P<0.05)。研究显示：鸭瘟病毒UL24基因疫苗有一定的免疫保护效果。

全文目录


中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第一章 动物黏膜免疫的研究进展  12-23
  1 动物黏膜免疫系统研究进展  12-18
    1.1 黏膜免疫系统的构成  12-17
    1.2 特异性黏膜免疫的机制  17-18
  2 以减毒沙门氏菌为载体的基因疫苗黏膜免疫的研究进展  18-21
    2.1 减毒沙门氏菌作为基因疫苗载体的优势  18-19
    2.2 减毒沙门氏菌的侵入机制  19-20
    2.3 携带基因疫苗的减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答的机制  20
    2.4 减毒沙门氏菌作为基因疫苗载体的应用  20-21
  3 选题目的及意义  21-23
第二章 携带真核质粒的减毒沙门氏菌的构建及其生物学特性的研究  23-44
  1 材料  24
    1.1 细菌及主要试剂  24
    1.2 主要仪器  24
  2 方法  24-32
    2.1 pMD-T18/LTB的构建  24-26
    2.2 真核表达质粒的构建与鉴定  26-30
    2.3 携带真核表达质粒的减毒沙门氏菌的构建  30
    2.4 重组沙门氏菌的生长特性  30-31
    2.5 重组沙门氏菌的体外稳定性试验  31
    2.6 E. coli LTB基因核苷酸序列分析  31
    2.7 鸭胚成纤维细胞的制备与体外感染  31-32
  3 结果  32-40
    3.1 E. coli LTB基因的PCR结果  32-33
    3.2 E.coli LTB基因的测序结果  33
    3.3 重组真核表达质粒鉴定结果  33-35
    3.4 携带真核表达质粒的减毒沙门氏菌的鉴定  35-36
    3.5 重组沙门氏菌的革兰氏染色镜检结果  36
    3.6 SL7207与重组减毒沙门氏菌生化特性的比较  36-37
    3.7 重组沙门氏菌的生长曲线  37-38
    3.8 体外重组沙门氏菌中质粒的稳定性  38
    3.9 LTB基因和LTB-UL24基因的生物信息学分析  38-39
    3.10 沙门氏菌传递的质粒在鸭胚成纤维细胞中的表达  39-40
  4 讨论  40-42
    4.1 双基因融合真核表达载体的构建  40
    4.2 重组菌的生物学特性  40-41
    4.3 重组菌的质粒稳定性  41-42
    4.4 减毒沙门氏菌SL7207的优越性  42
  5 小结  42-44
第三章 DPV UL24基因疫苗肌注免疫组免疫原性研究  44-53
  1 材料  44-45
    1.1 病毒、试验动物和主要试剂  44
    1.2 主要溶液的配制  44
    1.3 主要仪器  44-45
  2 方法  45-47
    2.1 免疫动物处理  45-46
    2.2 RT-PCR检测LTB、UL24和LTB-UL24基因在体内的转录  46
    2.3 鸭瘟病毒包被抗原的制备  46
    2.4 特异性DPV IgG、IgA和IgM的检测  46-47
  3 结果  47-51
    3.1 RT-PCR检测LTB、UL24和LTB-UL24基因在体内的转录  47
    3.2 肌注免疫组各器官抗体动态变化  47-48
    3.3 肌注免疫组免疫鸭血清中特异性DPV IgA与IgM的检测  48-49
    3.4 肌注免疫组免疫鸭在气管和十二指肠中特异DPV IgA、IgG与IgM的检测  49-51
  4 讨论  51-52
    4.1 DPV UL24基因表达蛋白的抗原性  51
    4.2 蛋白定位对免疫效果的影响  51-52
  5 小结  52-53
第四章 DPV UL24基因疫苗口服免疫组免疫原性研究  53-76
  1 材料  53-54
    1.1 病毒、试验动物和主要试剂  53
    1.2 主要溶液的配制  53-54
    1.3 主要仪器  54
  2 方法  54-57
    2.1 免疫动物处理  54-55
    2.2 重组沙门氏菌对鸭安全性试验  55
    2.3 RT-PCR检测LTB、UL24和LTB-UL24基因在体内的转录  55-56
    2.4 鸭瘟病毒包被抗原的制备  56
    2.5 沙门氏菌包被抗原的制备  56
    2.6 特异性DPV IgG、IgA和IgM的检测  56
    2.7 特异性沙门氏菌IgG、IgA和IgM含量测定  56-57
  3 结果  57-73
    3.1 重组沙门氏菌对鸭的安全性试验  57-58
    3.2 RT-PCR检测LTB、UL24和LTB-UL24基因在体内的转录  58-59
    3.3 抗DPV特异性IgA、IgG和IgM在免疫鸭各器官中的检测  59-60
    3.4 口服免疫组血清中特异性DPV IgA与IgM的检测  60-61
    3.5 口服免疫组气管中特异性DPV IgG、IgA与IgM的检测  61-63
    3.6 口服免疫组十二指肠中特异性DPV IgG、IgA与IgM的检测  63-65
    3.7 不同剂量口服免疫SL7207(LTB-UL24)组血清中特异性DPV IgA与IgM的检测  65-66
    3.8 不同剂量口服免疫SL7207(LTB-UL24)组气管中特异性DPV IgG、IgA与IgM的检测  66-68
    3.9 不同剂量口服免疫SL7207(LTB-UL24)组十二指肠中特异性DPV IgG、IgA与IgM的检测  68-70
    3.10 免疫鸭血清中特异性沙门氏菌IgG、IgA和IgM的ELISA检测  70-71
    3.11 免疫鸭肠道中特异性沙门氏菌IgG、IgA和IgM的ELISA检测  71-73
  4 讨论  73-75
    4.1 免疫途径对基因疫苗免疫效果的影响  73-74
    4.2 LTB的黏膜免疫佐剂效果  74
    4.3 免疫剂量对以沙门氏菌为载体的基因疫苗免疫效果的影响  74-75
  5 小结  75-76
第五章 鸭瘟病毒UL24基因疫苗免疫保护效果研究  76-81
  1 材料  76
    1.1 病毒  76
    1.2 试验动物  76
  2 方法  76-77
    2.1 半数致死量(LD_(50))的确定  76
    2.2 攻毒保护试验  76-77
  3 结果  77-78
    3.1 半数致死量(LD_(50))的确定  77
    3.2 免疫鸭保护效果  77-78
  4 讨论  78-79
  5 小结  79-81
参考文献  81-96
附表  96-110
附图  110-117
致谢  117-118
作者简介  118

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸭
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