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依达拉奉对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的保护机制研究

作　者: 贾珍
导　师: 郭力
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 多发性硬化实验性自身免疫性脑脊髓炎依达拉奉氧化应激铁代谢超氧化物歧化酶转铁蛋白受体
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统脱髓鞘为特征,以慢性进展并最终致残的临床过程为特点,以中青年女性为主要罹患人群的疾病,严重危害人类健康。目前该疾病的发病机制尚不明确,认为是多种致病因素如:免疫失调、地理差异、氧化应激、铁代谢失衡、炎症反应等综合作用的结果,因此对于多发性硬化的研究也成为神经科学领域研究的热点和难点。近几年自由基所引起的氧化应激和铁代谢失衡越来越受到人们的重视,发现它们在一系列神经变性疾病的发生发展中起着重要的作用,同样二者在多发性硬化的发病过程中所扮演的角色亦成为研究的热点之一。氧化应激是由于氧代谢产物与抗氧化防御系统失衡导致组织损伤的过程。铁超载会促进高毒性的氧自由基生成从而对神经细胞有损伤作用。体内存在一系列与氧化应激相关的酶类,超氧化物歧化酶(SOD1)是其中起保护作用的一员。铁是人体必需的微量元素,其代谢是通过体内的铁相关蛋白来完成的,如转铁蛋白、转铁蛋白受体、铁蛋白等。而氧化应激和铁代谢之间存在着复杂的关系,两者相互影响、相互作用通过一系列反应会对血脑屏障、神经元、髓鞘造成严重破坏。二者在多发性硬化的发生发展中所起的作用需要我们进一步的研究。依达拉奉最初是由日本发现并应用于临床的一种小分子的自由基清除剂,能抑制黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤氧化酶的活性,抑制氧自由基的产生,刺激前列环素的生成,减少炎症递质白细胞三烯的生成,降低羟自由基的浓度,并抑制迟发性神经元死亡。静脉给药后可以透过血脑屏障,清除脑内具有高度细胞毒性的羟基基团。体内试验显示依达拉奉还能抑制血管内皮细胞损害、减轻水肿、改善神经功能。因此我们推测依达拉奉的清除自由基和抑制炎症反应的作用对多发性硬化可能有治疗意义。本实验应用目前公认的多发性硬化动物模型—实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型,依达拉奉注射液作为干预药物,通过对实验动物的发病率、行为学改变、脑组织病理学改变以及超氧化物歧化酶1(SOD1)和转铁蛋白受体(transferrin,TfR)在脑组织中的动态表达变化探讨依达拉奉对EAE模型的保护机制和对该模型铁代谢的影响,从而帮助我们探索MS的发病机制,并为寻找新的治疗靶点提供理论基础。方法:1动物分组:将72只6-8周龄健康雌性Wistar大鼠,体重180-200g,随机分为正常对照组、EAE模型组、地塞米松(dexamethasone,DXM)组、依达拉奉组(10 mg·kg-1·d-1),每组各18只。每组又随机分为7天、16天、23天三个亚组,每个亚组6只大鼠。2模型制备:将新鲜豚鼠全脊髓制成匀浆,与完全福氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)混合,佐剂中含卡介苗的剂量为6mg/ml,经过乳化后按0.5ml/只分别于大鼠四足垫和背部皮下一点注射。药物治疗组于模型制备第一天起给予相应剂量的药物进行腹腔注射,每天注射一次药物持续给予至动物处死时为止。3神经功能评分:建立动物模型当日及免疫后每天对动物的体重、精神状态、活动情况进行观察,并对动物进行神经功能评分,采用Kono等提出的评分标准:1分:动物尾部无力;2分:尾部无力+肢体无力;3分:肢体轻度麻痹;4分:肢体严重麻痹,被动翻身后不能复原;5分:濒死状态。4组织病理学:在动物麻醉状态下,快速取其大脑侧脑室周围及脊髓颈、胸、腰膨大处组织,迅速置于4%多聚甲醛溶液固定,并石蜡包埋,制成组织切片,通过HE染色,在光学显微镜下观察组织中炎症细胞的浸润情况。5脑组织中超氧化物歧化酶(SOD1)和转铁蛋白受体(TfR)的测定:将实验动物于免疫后第7天、16天、23天时取脑组织固定后常规石蜡包埋,制成组织切片,应用SP法行免疫组织化学染色分别测定脑组织中不同部位(皮层、皮层下、脑室旁)SOD1和TfR的表达水平。结果:1发病率观察:依达拉奉组和DXM组大鼠的发病率均低于EAE组,差异有统计学意义(p<0.05)。2行为学观察:对各组大鼠在发病高峰期时神经功能评分比较,依达拉奉组、DXM组的神经功能评分明显低于EAE组(p<0.05)。3组织病理学观察:在发病前期(免疫后7天)EAE组大鼠脑组织内即出现炎性细胞浸润,且炎性细胞浸润程度与其临床表现相一致。在发病高峰期(免疫后16天),依达拉奉组、DXM组大鼠脑组织内炎症细胞浸润形成的血管袖套数目明显低于EAE组(p<0.05);依达拉奉组和DXM组,大鼠脑组织内炎症细胞浸润形成的血管袖套数目比较,差异没有统计学意义(p>0.05)。疾病缓解期(免疫后23天)各组大鼠脑组织内的血管袖套数目差异均没有统计学意义(p>0.05)。4脑组织中SOD1和TfR的表达:4.1超氧化物歧化酶(SOD1):EAE组在3个时间点、不同部位SOD1的表达水平较正常对照组、依达拉奉组、DXM组均明显减低,EAE组3个时间点相比均有统计学差异(p<0.05)。依达拉奉组与DXM组比较无统计学差异。仅发病高峰点(16天),依达拉奉组、DXM组较正常对照组SOD1表达水平下降,有统计学差异(p<0.05)。同组在不同时间点大鼠脑组织不同部位(皮层、皮层下、脑室旁)SOD1的表达水平的变化呈相同趋势。4.2转铁蛋白受体(TfR):EAE组TfR表达水平随疾病的发展有明显的变化呈逐渐上升的趋势,3个时间点比较差异均有统计学意义。DXM组TfR表达水平随疾病的发展有明显的变化呈现降低后升高的趋势,3个时间点比较有统计学差异。依达拉奉组TfR表达水平随疾病的发展呈先稳定后降低的趋势。结论:1 EAE大鼠脑组织中SOD1和Tfr的表达水平与疾病的病程相关。2 EAE大鼠脑组织中不同部位(皮层、皮层下、脑室旁)SOD1和TfR均有变化,呈相同趋势,即在EAE的发生发展中不仅在脑室旁组织有改变,皮层处组织也受影响。3依达拉奉对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠能够起到保护作用,表现为能够降低EAE大鼠的发病率,减轻其疾病的严重程度及缓解炎症细胞在脑组织中的浸润严重程度。4依达拉奉可以通过清除自由基保护脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD1)使机体的抗氧化能力增强,并且对转铁蛋白受体(TfR)有调节作用。5依达拉奉与地塞米松比较,虽然依达拉奉干预组在发病率和功能评分上对EAE的保护作用不及地塞米松干预组,但是依达拉奉由于其副作用小,可以较长时间应用,因此表现出较大的优势。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
研究论文依达拉奉对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的保护机制研究  12-40
  前言  12-13
  材料与方法  13-17
  结果  17-27
  附图  27-30
  附表  30-33
  讨论  33-36
  结论  36-37
  参考文献  37-40
综述多发性硬化与铁代谢失衡  40-48
致谢  48-49
个人简历  49

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