学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

猪IL-2对JEV EⅢ’-PPV VP2共表达基因疫苗免疫原性影响的初步研究

作　者: 肖义蓉
导　师: 王印；郭万柱
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪IL-2基因 VP2基因 EⅢ’基因 核酸疫苗 免疫原性
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 25次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


本研究分别扩增JEV CQRC-1株E蛋白结构域Ⅲ上线性中和抗原表位EⅢ′基因和PPV SC-1株VP2基因,然后运用重叠PCR将VP2基因和EⅢ′基因通过Linker连接构建得到融合基因EⅢ’-VP2,并将其定向克隆到pMDl9-TSimple载体上。再将EⅢ’-VP2目的基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)得到共表达重组质粒pcDNA-EⅢ’.VP2.PCR扩增猪IL-2基因,将其定向插入真核载体pcDNA3.1(+)和重组载体pcDNA-EⅢ’.VP2得到重组质粒pcDNA-IL2和pcDNA-IL2-EⅢ’.VP2.采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA-EⅢ’.VP2和pcDNA-IL2-EⅢ’.VP2 DNA转染哺乳动物细胞Vero细胞,其表达产物通过RT-PCR和间接免疫荧光法检测目的基因的转录与表达,能观察到目的条带和间接免疫荧光,证明成功构建了pcDNA-EⅢ’.VP2和pcDNA-IL2-EⅢ’.VP2真核载体。将重组质粒pcDNA-IL2-EⅢ’.VP2(A组)、pcDNA-IL2/pcDNA-EⅢ’.VP2 (pcDNA-IL2先于pcDNA-EⅢ’.VP2三天注射,B组)、pcDNA-EⅢ’.VP2/pcDNA-IL2 (pcDNA-EⅢ’.VP2先于pcDNA-IL2三天注射,C组)、pcDNA-EⅢ’.VP2(D组)免疫BALB/c鼠,同时设立猪细小灭活苗(E组)、猪乙脑弱毒疫苗(F组)和pcDNA3.1(+)空载体组(G组)作为对照组,免疫3次,间隔两周。通过检测免疫小鼠血清JEV(PPV)抗体效价、脾淋巴细胞增殖功能、外周血T细胞亚群值变化比较了重组猪IL-2对pcDNA-EⅢ’-VP2核酸疫苗免疫增强作用。结果显示首免1周后各实验组JEV/PPV抗体水平明显高于空载体对照组,A、C组显著或极显著高于D组,B组抗体水平二免后上升较快,显著高于D组。细小疫苗组PPV抗体水平除第5周显著低于D组外,其他时间与D组抗体水平差异均不显著。乙脑疫苗组JEV抗体水平第5周与A、B、C三组差异不显著,其他时间显著或极显著高于A-D四组。二免后,各组均能诱导小鼠产生较强的脾细胞增殖,A、B、C组SI值显著或极显著高于D组,其中A、C组极显著高于B组,质粒组SI值始终高于细小疫苗组,却低于乙脑疫苗组。CD4+值和CD4/CD8值显示A、B、C三组值均高于D组,其中A组最高,但A、B、C三组间CD8+值差异不具统计学意义(P>0.05),各组CD4+、CD8+值都低于乙脑疫苗组,高于细小疫苗组。结果表明,共表达真核质粒pcDNA-EⅢ’.VP2能诱导小鼠产生一定的体液和细胞免疫；重组猪IL-2对pcDNA-EⅢ’.VP2共表达核酸疫苗免疫原性有很好的增强作用,其中IL-2与EⅢ’-VP2形成融合基因构建的核酸疫苗免疫效果最好。研究结果为新型、高效的乙脑和细小疫苗提供了数据参考。

全文目录


中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
1 文献综述  11-26
  1.1 猪乙型脑炎病毒相关简介  11-16
    1.1.1 乙型脑炎病毒  11
    1.1.2 JEV及其基因组的结构  11-12
    1.1.3 JEV的基因组特性  12
    1.1.4 乙型脑炎病毒E蛋白结构及特性  12-13
    1.1.5 E蛋白抗原表位的研究  13-14
    1.1.6 乙脑病毒核酸疫苗的相关研究  14-16
  1.2 猪细小病毒相关简介  16-19
    1.2.1 猪细小病毒  16-17
    1.2.2 PPV基因组及其产物  17-18
    1.2.3 VP2基因及其编码蛋白的功能  18-19
    1.2.4 VP2基因应用于核酸疫苗的相关研究  19
  1.3 有关白介素2的相关综述  19-23
    1.3.1 白细胞介素及其作为分子佐剂的应用  20
    1.3.2 猪白细胞介素2及其作为分子佐剂的研究进展  20-22
    1.3.3 IL-2在DNA疫苗免疫增强剂方面的应用  22-23
  1.4 重叠延伸PCR的相关简介  23-25
    1.4.1 重叠延伸PCR  23-24
    1.4.2 重叠延伸PCR的应用  24-25
  1.5 实验目的、意义  25
  1.6 问题及展望  25-26
2 材料  26-28
  2.1 实验材料  26-27
  2.2 主要仪器  27
  2.3 主要溶液配制  27-28
    2.3.1 细胞培养用液  27
    2.3.2 大肠杆菌感受态细胞制备及转化用溶液  27-28
    2.3.3 琼脂糖凝胶电泳所用溶液  28
    2.3.4 抗凝血所用溶液  28
3 实验方法  28-42
  3.1 试验中PCR扩增所用引物的设计与合成  28
  3.2 JEV EⅢ′基因的获得  28-31
    3.2.1 质粒pMD-E的抽提  28-29
    3.2.2 JEV EⅢ′基因的PCR扩增  29-30
    3.2.3 目的DNA片段的回收  30-31
  3.3 PPV VP2基因的获得  31-32
    3.3.1 pPVP2质粒的抽提  31
    3.3.2 PPV VP2基因的PCR扩增  31-32
    3.3.3 目的DNA片段的回收  32
  3.4 重叠延伸PCR扩增EⅢ′-VP2基因  32
  3.5 基因EⅢ′-VP2的克隆  32-34
    3.5.1 目的DNA片段的回收  32-33
    3.5.2 大肠杆菌(DH5α)感受态细胞的制备  33
    3.5.3 连接与转化  33
    3.5.4 重组质粒的筛选及鉴定  33-34
  3.6 共表达真核载体pcDNA-EⅢ′.VP2(pcDNA-E.V)的构建  34-35
    3.6.1 真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒DNA的获得  34
    3.6.2 pMD-E.V和pcDNA3.1的酶切回收  34-35
    3.6.3 连接与转化  35
    3.6.4 重组质粒pcDNA-E.V的筛选与鉴定  35
  3.7 IL-2基因的获得  35-36
    3.7.1 质粒pET32a-IL2的抽提  35
    3.7.2 IL-2基因的PCR扩增  35-36
  3.8 猪IL-2基因的克隆  36-37
    3.8.1 目的DNA片段的回收  36
    3.8.2 连接与转化  36
    3.8.3 重组质粒的筛选及鉴定  36-37
  3.9 pcDNA-IL2的构建  37-38
    3.9.1 pMD-IL-2和pcDNA3.1的酶切回收  37
    3.9.2 连接与转化  37
    3.9.3 重组质粒pcDNA-IL2的筛选与鉴定  37-38
  3.10 融合表达载体pcDNA-IL2-EⅢ′.VP2(pcDNA-2-E.V)的构建  38
    3.10.1 重组载体pcDNA-E.V酶切开环及回收  38
    3.10.2 连接与转化  38
    3.10.3 重组质粒的鉴定  38
  3.11 重组质粒pcDNA-E.V、pcDNA-2-E.V转染Vero细胞  38-39
    3.11.1 去内毒素的质粒DNA的抽提  38-39
    3.11.2 质粒DNA的转染  39
  3.12 RT-PCR法检测目的基因的转录情况  39
  3.13 间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白的体外表达  39-40
  3.14 重组质粒免疫原性的初步研究  40-42
    3.14.1 重组质粒的大量制备及纯化  40-41
    3.14.2 小鼠的分组及免疫接种  41
    3.14.3 ELISA检测小鼠血清中PPV/JEV抗体  41-42
    3.14.4 小鼠脾淋巴细胞增殖反应试验  42
    3.14.5 小鼠T淋巴细胞亚群检测  42
4 结果  42-52
  4.1 EⅢ′基因的PCR扩增  42-43
  4.2 VP2基因的PCR扩增  43
  4.3 EⅢ′-VP2基因的克隆  43-44
    4.3.1 基因EⅢ′-VP2的PCR扩增  43-44
    4.3.2 pMD-E.V质粒的酶切鉴定  44
    4.3.3 pMD-E.V质粒的测序鉴定  44
  4.4 真核表达质粒pcDNA-E.V的酶切鉴定  44-45
  4.5 猪IL-2基因的克隆  45-46
    4.5.1 猪IL-2基因的PCR扩增  45
    4.5.2 重组质粒PMD-IL-2的酶切鉴定  45
    4.5.3 PMD-IL-2质粒的测序鉴定  45-46
  4.6 重组质粒pcDNA-IL-2的鉴定  46
  4.7 重组质粒pcDNA-IL2-E.V的鉴定  46-47
  4.8 RT-PCR法检测重组质粒的转录情况  47
  4.9 重组质粒转染细胞后的免疫荧光检测  47-48
  4.10 疫苗诱导小鼠体液免疫应答效果的比较  48-52
    4.10.1 JEV抗体的检测  48-49
    4.10.2 PPV抗体的检测  49-50
    4.10.3 疫苗诱导的脾淋巴细胞增殖效果比较  50-51
    4.10.4 小鼠外周血T淋巴细胞亚群分析比较  51-52
5 讨论  52-57
  5.1 抗原表位的选择  52-53
  5.2 重叠PCR连接目的抗原基因  53
  5.3 真核表达载体的选择与构建  53-54
  5.4 佐剂  54-55
  5.5 转染与表达  55
  5.6 免疫原性讨论  55-57
    5.6.1 体液免疫  55-56
    5.6.2 细胞免疫  56-57
6 小结  57-59
参考文献  59-65
致谢  65

相似论文

  1. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  2. IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达与应用,S852.65
  3. 犬细小病毒2型VP2基因在昆虫细胞中的表达及血清抗体间接ELISA检测方法的建立,S852.65
  4. 传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因在家蚕中的表达及亚单位疫苗的初步研究,S855.3
  5. 鸡传染性法氏囊病毒颗粒疫苗的研制及其免疫效果的研究,S858.31
  6. 日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的初步研究,R392.1
  7. 展示生长抑素的猪细小病毒样颗粒构建及其免疫效力研究,S852.65
  8. 密码子优化对乙肝病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫原性的影响,R392
  9. 犬细小病毒环介导等温扩增方法的建立和VP2基因的克隆表达,S852.65
  10. 牛分枝杆菌ESAT-6和MPT83蛋白的表达、纯化及其在ELISA方法中初步应用的研究,S858.23
  11. 嵌合猪圆环病毒的构建及其对仔猪的免疫原性,S858.28
  12. 布鲁氏菌omp31、omp2b基因重组山羊痘病毒的构建及免疫原性初步研究,S858.23
  13. 转融合基因K88ac-STⅡ-LTA2/LTB苜蓿的获得及其外源K88ac蛋白的检测与分析,S541.9
  14. 加热对尖吻蝮蛇蛇毒及其组分免疫原性及生物毒性的影响,R96
  15. DNA疫苗预敏蛋白疫苗增强策略对乙型肝炎病毒表面抗原蛋白免疫应答的影响,R392
  16. 大肠杆菌LTB增强PRRSV-GP5蛋白免疫原性的研究,R392
  17. 呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗的初步研究,R392.1
  18. 犬细小病毒VP2基因的克隆、表达及其重组蛋白的抗原性研究,S852.65
  19. PRRSV灭活疫苗安全性与免疫原性的测定及其RT-PCR鉴别检测方法的建立,S858.28
  20. 猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫杆状病毒表达系统的表达及亚单位疫苗的初步研究,S858.28
  21. 国产流感裂解疫苗上市后安全性和免疫原性研究,R392

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
© 2012 www.xueweilunwen.com