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PRRSV灭活疫苗安全性与免疫原性的测定及其RT-PCR鉴别检测方法的建立

作　者: 王隆柏
导　师: 邵良平；周伦江
学　校: 福建农林大学
专　业: 临床兽医学
关键词: PRRSV RT-PCR 建立灭活疫苗安全性免疫原性
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

根据GenBank已发表及本研究室分离鉴定的变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的NSP2基因序列,设计并合成了一对引物,建立了一种鉴别PRRSV的RT-PCR检测方法。结果表明：该方法扩增变异型PRRSV基因组时可获得217bp的片段,扩增普通PRRSV时则获得307bp的片段,同条件扩增猪瘟病毒(CSFV)、圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)、伪狂犬病病毒(PRV)均为阴性；该体系可检测到2.6pg的PRRSV核酸,具有较高敏感性。对2007-2008年送检的40份临床样品进行检测,结果检出12份为变异PRRSV,其阳性率为30.0%。研究结果表明,建立的RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点,适用于对猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别诊断。选用猪繁殖与呼吸综合征病毒福建分离株(PRRSV-FuZhou-01株)为制苗种毒。病毒经Marc-145细胞增殖、超速离心、浓缩、甲醛灭活后,分别制成新型佐剂IMS1312灭活疫苗和油乳剂灭活疫苗,两种疫苗病毒含量约为108.0TCID50ml-1。30头25日龄的PRRSV抗体阴性的断奶猪被随机分成5组,每组6头,用于检测疫苗的安全性和免疫原性。结果表明两种疫苗首次免疫断奶仔猪后14d可以检测到抗体,二免14d抗体水平达到高峰,一免180d后抗体水平可以维持在1：320。两种佐剂苗在4℃放置12个月均不分层,并对断奶仔猪具有良好的安全性和免疫原性。

全文目录

目录  5-9
摘要  9-10
ABSTRACT  10-12
第一章文献综述(猪繁殖与呼吸综合征病毒概论)  12-26
  1 猪繁殖与呼吸综合征  12
  2 PRRS的发现及危害  12-13
  3 PRRS的病原特性  13-18
    3.1 PRRSV的形态特征  13
    3.2 PRRSV的培养特性  13-14
    3.3 PRRSV的理化特性  14
    3.4 PRRSV的遗传变异及抗原性  14-15
    3.5 PRRSV的毒力变异  15-16
    3.6 分子生物学特征  16-18
      3.6.1 基因组结构  16
      3.6.2 结构蛋白  16-18
  4 PRRS的发病机理  18-19
  5 PRRS的流行病学  19-20
    5.1 传播途径  19
    5.2 临床症状及病理变化  19-20
  6 PRRS的诊断  20-22
    6.1 临床诊断  20
    6.2 PRRS的病毒分离  20
    6.3 PRRS的血清学诊断  20-22
    6.4 PRRS的分子生物学诊断  22
      6.4.1 RT-PCR方法  22
      6.4.2 核酸探针杂交技术  22
  7 PRRS疫苗研究进展  22-25
    7.1 灭活疫苗  22-23
    7.2 弱毒疫苗  23-24
    7.3 基因疫苗  24-25
  8 PRRS的防治  25-26
    8.1 预防  25
    8.2 治疗  25-26
第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别检测方法的建立  26-34
  1 材料  26-28
    1.1 毒株及细胞  26
    1.2 主要试剂  26-27
    1.3 主要仪器  27
    1.4 病料  27
    1.5 培养基与抗生素及其配制  27-28
      1.5.1 DMEM细胞培养液  27
      1.5.2 RPMI-1640培养液  27
      1.5.3 细胞消化液  27-28
  2 方法  28-30
    2.1 病毒培养  28
    2.2 RNA及DNA模板的制备  28
    2.3 引物的设计与合成  28-29
    2.4 RT-PCR反应体系建立  29
    2.5 特异性测定  29
    2.6 敏感性测定  29
    2.7 重复性测定  29
    2.8 临床送检样品检测  29-30
    2.9 RT-PCR扩增条带的序列测定  30
  3 结果  30-32
    3.1 特异性检测  30
    3.2 敏感性检测  30-31
    3.3 重复性检测  31
    3.4 RT-PCR扩增条带的序列测定  31
    3.5 临床送检样品检测  31-32
  4 分析与讨论  32-34
第三章猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的安全性及免疫原性的测定  34-41
  1 材料  34-35
    1.1 种毒  34
    1.2 试验动物  34
    1.3 主要仪器  34
    1.4 培养基与抗生素的配制  34-35
      1.4.1 DMEM细胞培养液  35
      1.4.2 RPMI-1640培养液  35
      1.4.3 细胞消化液  35
    1.5 佐剂  35
  2 方法  35-37
    2.1 PRRSV增殖  35
    2.2 PRRSV浓缩  35-36
    2.3 PRRSV灭活疫苗制备  36
      2.3.1 PRRSV灭活及灭活效果检  36
      2.3.2 新型佐剂IM1312灭活疫苗制备  36
      2.3.3 油乳灭活疫苗制备  36
    2.4 疫苗质量检验  36-37
      2.4.1 物理性状  36
      2.4.2 稳定性  36
      2.4.3 无菌检验  36-37
      2.4.4 安全性试验  37
    2.5 疫苗免疫原性测定  37
      2.5.1 免疫接种  37
      2.5.2 抗体检测  37
    2.6 疫苗保存期测定  37
  3 结果与分析  37-40
    3.1 PRRSV的灭活检验  37-38
    3.2 疫苗质量检验  38
      3.2.1 物理性状测定  38
      3.2.2 稳定性  38
      3.2.3 无菌检验  38
      3.2.4 安全性检验  38
    3.3 疫苗免疫原性测定  38-39
    3.4 疫苗保存期测定  39-40
  4 讨论  40-41
结论  41-42
参考文献  42-48
致谢  48

PRRSV灭活疫苗安全性与免疫原性的测定及其RT-PCR鉴别检测方法的建立

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